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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(5): 725-731. |
| Effect of Steroid Administration on Immune-Mediated Sensorineural Hearing Loss in MRL/MP-lpr/lpr Mice. |
| Kyung You Park, Jeong Bae Kim, Chin Hak Cho, Chin Saeng Cho, Koji Hozawa, Tomonori Takasaka |
1Department of Otolaryngology, College of Medicine, Hallym University, Chuncheon, Korea.
2Department of Otolaryngology, School of Medicine, Tohoku University, Sendai, Japan. |
| 면역-중개에 의한 감각신경성난청을 보인 MRL/MP-<i>lpr/lpr</i> 쥐에 스테로이드 투여가 미치는 영향 |
| 박경유1 · 김정배1 · 조진학1 · 조진생1 · 朴澤 孝治2 · 高坂 知節2 |
| 한림대학교 의과대학 이비인후과학교실1;東北大學校 醫科大學 耳鼻咽喉科學敎室2; |
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| ABSTRACT |
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In our daily clinical practice, we have come across several patients suffering from a fluctuating sensorineural hearing loss of unknown origin. Such patients were sometimes treated with sucess by steroid administration. Some kinds of immune injury in the inner ear have been proposed as a possible pathogenesis. However, the minute mechanisms of immune injury in the inner ear and the way in which steroids improve the hearing loss remained obscure. We have previously reported that the MRL/MP-lpr/lpr(MRL/lpr) autoimmune strain of mice showed IgG deposition in the stria vascularis with elevated thresholds of auditory brainstem response. This strain of mice though to be a good model for studying immune mediated inner ear dysfunction. The purpose of this study was to evaluated the therapeutic efffects of prednisolone on the hearing impairment in MRL/lpr mice, morphologically and electrophysiologically. |
| Keywords:
SteroidㆍImmune-mediated sensorineural hearing lossㆍMRL/lpr mice |
서론
우리는 임상에서 흔히 원인 불명의 변동성 감각신경성 난청으로 고생하는 환자들을 만나게 된다. 그리고 이러한 환자들이 때때로 스테로이드 투여에 의해 성공적으로 치료되는 것으로 미루어 보아 내이에서의 어떠한 면역 손상이 변동성 감각 신경성 난청의 가능한 병리 기전으로 관여할 것이라 가정하여 왔다. 그렇지만 내이에서의 면역 손상의 정확한 기전들과 스테로이드 투여가 어떻게 청력을 회복시키는가는 아직까지 밝혀져있지 않은 상태이며, Kusakari등1)은 MRL/MP-lpr/lpr(이하 MRL/lpr로 약함) 자가면역 계통의 쥐에서 혈관조에 IgG 침착과 뇌간유발청력 검사상 역치상승을 보인다고 보고한 바 있으며, 이 계통의 쥐는 면역반응으로 인한 내이 질환의 연구에 좋은 모델이 될 것이라 사료되어 본 저자들은 청력 저하를 보인 MRL/lpr쥐에 대한 predonisolone의 치료적 효과를 형태학적으로 또한 전기 생리학적으로 연구해 보았다.
재료와 방법
1. 실험동물
MRL/lpr 계통 쥐를 Jackson 실험실로부터 구입하여 무균상태에서 사육하였다.
2. Prednisolone 투여
1mg의 prednisolone을 1ml의 증류수에 용해시켜 다섯 마리의 수컷 MRL/lpr쥐에게 8mg/kg/day의 용량으로 복강내 주사하였다. 초회 주사는 각각의 쥐에 대해 생후 7주째에 주사하여 일주일에 5일씩 10주간 반복하였으며 마지막 주사 후 1주일 후에 검사를 시행하였으며, 세마리의 수컷 MRL/lpr 쥐를 대조군으로 삼아 복강내에 증류수만 주사하였다.
3. 뇌간유발청력검사(Auditory brainsteme response)
Sodium pentobabital을 복강내로 주사하여 마취시킨 후 뇌간유발청력검사를 이용하여 동물들의 청력을 측정하였다. 전극 침을 우측낭포(bulla)와 두정부(vertex)에 위치시킨 후 90μsec clicks의 음자극을 우측 귀에 장착한 작은 스피커를 통해 교대상으로 주었다. 음자극의 반복속도는 초당 20회로 하였고 신호는 Band-pass(80 to 400 Hz) 여과되었고 1000회를 평균하였다. 뇌간유발청력검사의 역치는 진폭이 0.1μV인 Wave I을 만들어 내는 자극의 정도로 정의하였으며 뇌간유발청력검사 결과의 기록 후 와우의 병리 상태에 대한 검사를 시행하였다.
4. 전자현미경 관찰
18주된 두마리의 스테로이드 치료군 쥐와 한 마리의 대조군 쥐를 에테르 마취하에서 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate 완충액으로 심장내 고정하였고 동일한 고정액으로 외림프 관류하였다. 와우로부터 현미경하에서 미세절개하여 얻어진 혈관조를 0.25% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate 완충액에 섭씨 4도로 하룻밤 동안 담구었다. 모든 병리 표본들을 상온에서 한 시간 동안 1% osmium tetroxide에서 후고정하였고 graded alcohol과 propylene oxide로 탈수시켜 Epon 812에 포매하였다. 초박절편을 만들어 uranyl acetate와 lead acetate로 염색한 다음 80kV의 가속 전압에서 JEOL 100C 전자현미경으로 관찰하였다.
5. 면역조직학적 관찰
스테로이드 치료군 중 한 마리는 에테르 마취하에서 periodate-lysine-paraformaldehyde(PLP fixative；2% paraformaldehyde with 0.075M lysin and 0.01M sodium periodate) 고정액으로 심장내 관류하여 고정하였고 혈관조를 분리 채취한 후 미세절개하여 자당이 포함된 PBS로 세척후 OCT compound(Miles Laboratories Inc., Kankakee, IL)에 심었다. 5μm 두께로 냉동 절편들을 만들어 10% normal skin milk에서 상온으로 15분간 전배양하고 biotinylated horse antimouse immunoglobulin G(Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA)로 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 보관하였다. avidin-biotin 복합물(ABC Kit pk400, Vector Laboratories Inc.)과 diamninobenzidine반응으로 면역반응을 관찰하였고, 절편들은 1% osmium tetroxide로 후고정하였고 ethanol에서 탈수시킨 다음 Epon 812 에 심고 초박절편을 얻어 염색없이 투과형 전자현미경(JEOL 100C)하에서 관찰하였다.
6. Na,K-ATPase 관찰
두마리의 대조군쥐와 스테로이드 치료받은 한 마리의 쥐를 2% paraformaldehede와 0.25% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate 완충액(PH 7.4)으로 심장내관류하여 고정하였으며 외림프관류도 시행한 후 동일한 고정액에 30분간 담구었다. 이것들을 0.25M sucrose와 10% dimethyl sulfoxide가 첨가된 0.01M cacodyl-ate 완충액으로 섭씨 4도에서 하룻밤동안 세척한후 섭씨 37도에서 30분 동안 반응 배지에서 배양하였다. 배지는 4.0mM lead citrate, 25% dimethyl sulfoxide, 10mM p-nitrophenylphosphate and 2.5mM levamisole in 250mM glycine KOH buffer PH 9.0을 포함한다. 이들을 1% osmium tetroxide에 후고정시키고 graded ethanol에서 탈수시킨 후 Epon 812에 심었다. 초박절편들을 잘라서 uranyl acetate와 염색한 후 80 kV로 가속한 투과형 전자현미경(JEOL 100C) 하에서 관찰하였다.
결과
1. 뇌간유발청력검사(ABR)
대조군에서 뇌간유발청력검사의 평균역치는 23.6dB, 범위는 20∼26dB이었으나 스테로이드 투여군은 평균역치 13.4dB, 범위는 0∼24dB로 대조군과 스테로이드 치료군간의 뇌간유발청력검사(Fig. 1A)의 차이는 통계학적으로 유의하였다(p<0.05)(Fig. 1B).
2. 형태학적 소견
대조군의 MRL/lpr쥐에서 혈관조 모세혈관의 기저막이 부정형의 전자집중물질(electron-dense material)로 두꺼워졌다. 이러한 전자집중물질은 혈관조 변연세포의 basal infolding에서 주로 관찰되었고 Hump양 모습을 나타냈으며 변연세포와 중간세포 사이의 세포간격의 확장이 대조군 쥐의 혈관조에서 관찰되었다(Fig. 2A). 그러나 이러한 소견들이 스테로이드를 투여한 MRL/lpr쥐에서는 거의 관찰되지 않았으며 혈관조의 미세구조는 오히려 정상 모습을 보였다(Fig. 2B). 대조군 쥐의 혈관조 모세혈관들의 기저막의 평균 두께는 0.46±0.20μm인 반면에 스테로이드 치료군의 평균 두께는 0.17±0.09μm로 이는 대조군에 비해 통계학적으로 유의하게 얇은 것이다(p<0.0001)(Fig. 3A, 3B). 또한 Immunoperoxidase 기법으로 18주된 쥐의 혈관조 모세혈관들의 기저막에 IgG의 침착을 관찰하였으나(Fig. 4A), 스테로이드치료를 받은 MRL/lpr쥐에서는 이러한 소견이 관찰되지 않았다(Fig. 4B). Mayahara등2)의 onestep lead citrate 방법으로 스테로이드 치료를 받은 MRL/lpr쥐에서 정상 동물들에서처럼 혈관조 주변세포의 basolateral infolding을 따라 Na,K-ATPase에 대한 reaction product의 조밀한 침착을 보여주었으나(Fig. 5A) 대조군 MRL/lpr쥐에서는 관찰되지 않았다(Fig. 5B).
고찰
Murphy와 Roths3)는 MRL/lpr 쥐를 전신성 홍반성루프스의 동물 모델로 확립하였으며 이 쥐모델은 림프증식유전자(lymphoproliferation gene, lpr)를 가진 것으로 현저한 림프 증식과 진행하는 전신성 홍반성루프스양 증상들이 나타난다.4) 과도한 비정상의 T림프구들의 축적과 B세포의 활성화의 결과로 혈장 immunoglobuline, immune complex, rheumatoid factors, antigp-70와 anti-DNA antibodies의 농도가 높아지게 되며, 이로 인해 저절로 육아종성 동맥염, 관절염과 면역복합체 매개에 의한 사구체신염이 나타나는 특징을 가진 모델인 것이다. Stephen등5)은 청력장애가 어떠한 종류의 전신적 면역질환과 연관이 있다고 보고하였으며, Trune등6)은 C3H/lpr 자가면역계통 쥐에서 청력장애와 혈관조의 퇴화가 관계가 있음을 발견하였다. Kusakari등1)은 혈관조의 중간세포들이 퇴화되고 청력소실을 보인 20주된 MRL/lpr쥐들의 혈관조 모세혈관의 기저막에서의 IgG 침착을 보고하였고 MRL/lpr쥐들이 면역매개에 의한 감각신경성 난청의 연구에 좋은 실험적 모델이 될 것이라고 제안하였다.
1979년에 McCabe7)는 처음으로 특정한 형태의 감각신경성 난청이 자가면역에 기인한다고 추정하였고 이러한 환자들의 치료에 고용량의 스테로이드와 alkylating cyclophosphamide 의 병용치료를 추천하였다. 그 이후에 여러 저자들이8)9) 면역매개에 의한 난청과 변동성 난청이 의심되는 경우에 스테로이드의 투여 효과에 대하여 보고하였다. Glucocorticoid가 강력한 면역 억제 물질인 까닭에 내이의 기능장애를 일으키는 원인이 되는 국소적이거나 혹은 전신적인 면역반응을 억제할 수도 있을 것이다. 그러나 감각신경성 난청에 대한 스테로이드 치료의 정확한 약리학적인 기전은 밝혀져있지 않은 상태이다.
본 연구는 스테로이드 투여가 혈관조에서 IgG의 침착을 줄이고 혈관조를 퇴화로부터 보호하며 청력을 보존한다는 것을 보여주었고 Koizumi등10)은 자가면역질환의 MRL/lpr쥐에대한 betamethasone의 장기 투여의 약리학적 효과를 조사하여 고농도의 betamethasone 투여가 림프증식을 예방하고 혈장내 자가항체의 수치를 낮추며 단백뇨와 피부병변 등과 같은 임상적 증상들을 호전시킨다고 보고하였다. 이러한 결과들에 의거하여 면역 매개로 인한 청력손실에 대한 스테로이드 투여의 효과를 몇가지 기전으로 설명할 수 있다. 첫째, 스테로이드는 내이에 직접 작용하여 혈관조 모세혈관의 기저막에 IgG 침착을 줄여 주고 기능을 보존한다. 둘째, 스테로이드는 전신적인 면역학적 질환을 개선시켜 혈관조에 IgG 침착을 줄여준다. 마지막으로 청력장애의 개선은 주로 보존된 신기능에 기인한다. MRL/lpr 쥐들은 모두 6주에서 8주 사이에 면역복합체 사구체신염에 의한 신기능장애로 죽었으며, 신기능장애 환자의 20∼50%에서 난청이 관찰되었다. 그러므로 이러한 가능성에 대하여도 고려되어야 할 것이다.
다른 흥미로운 결과는 스테로이드치료를 받은 동물들의 혈관조 변연세포들의 Na, K-ATPase 활동성이 보존된다는 것이다. Rarey등11)은 부신 적출된 동물들의 혈관조에서 Na, K-ATPase 활동성이 대조군에 비하여 유의하게 감소된 것을 발견하였다. 또한 부신적출된 동물에서 중간세포의 부종과 세포간격의 증가를 발견하였으며 corticosteroid가 혈관조의 구조적인 안정성을 조절할 뿐만 아니라 Na, K-ATPase 활동성을 조절한다고 제안하였다. Mineralocorticoid와 glucocorticoid는 수용체 단백질과 결합하여 Na, K-ATPase를 증가시키는 것으로 알려져 있다. ATPase는 신체 전반의 이온과 수분의 항상성 유지를 위한 능동수송기전이 일어나는 곳에서 관찰되며 이 효소는 와우에서 와우내 전류(endocochlear potential)의 생성에 핵심적인 역할을 한다. MRL/lpr쥐들에 있어서 Na, K-APTase 활동성은 혈관조에서 무시될 수도 있으나 이것이 와우내전류를 변조시켜 결과적으로 난청의 원인이 될 수도 있다. 그러므로, Kusakari등1)은 MRL/lpr쥐들에게 있어서 감각신경성 청력감퇴의 원인이 혈관조의 변화보다는 기능적 장애에 의한 것일지도 모른다고 하였으며 Na, K-ATPase 퇴화의 정확한 기전은 알려져 있지 않으나 IgG 침착의 분포와 Na, K-ATPase의 분포가 일치하는 것으로 미루어 보아 형태의 면역적 손상에 의한 것으로 고려될 수 있다. 스테로이드의 투여는 면역억제 효과뿐만 아니라 Na, K-ATPase에 직접적인 효과에 의해서 Na, K-ATPase 활동성을 보존할 수 있을 것으로 사료된다.
결론
1) 뇌간유발청력검사를 통한 청력역치를 측정한 결과 대조군에서 23.6dB의 평균청력역치를 보이는 것에 비해 스테로이드 투여군에서는 13.4dB의 평균청력역치를 보여 두 군 간에는 의미있는 차이가 있으며 이는 스테로이드가 효과적으로 MRL/lpr마우스에 있어 면역중개에 의한 감각신경성 난청의 발생을 억제하는 것으로 보여진다.
2) 대조군의 혈관조 모세혈관의 기저막 두께는 평균 0.46μm이었고 스테로이드 투여군의 기저막 두께는 평균 0.17μm를 보여 기저막의 비후가 관찰되지 않았다.
3) 면역전자현미경으로 대조군의 비후된 혈관조 모세혈관의 기저막에 IgG의 침착이 관찰되며 이는 스테로이드 투여군에서는 거의 관찰되지 않아 기저막의 비후는 IgG의 침착의 결과로 생각되며 스테로이드는 이와같은 IgG가 침착되는 것을 억제하는 것으로 보여진다.
4) 스테로이드 투여군에서 혈관조 변연세포의 basolateral infolding상의 Na, K-ATPase의 활동성을 reaction product의 형태로 관찰할 수 있었으나 대조군에서는 reaction products를 거의 관찰할 수 없었으며 이와 같은 Na, K-ATPase의 활동성의 저하로 인해 와우내 전류의 변화를 가져와 난청을 유발하는 것으로 생각된다.
이상으로 본 연구는 어떤 종류의 면역학적인 배경과 연관되어 청력이 소실된 환자들에 대한 스테로이드 투여의 타당성에 대한 기본적인 정보를 제공하였다.
REFERENCES
1) Kusakari C, Hozawa K, Koike S, et al：MRL/MP-lpr/lpr mouse as a model of mmuje-induced sensor-ineural hearing loss. Ann Otolo Rhinol Laryngol. 1992 ；101：82-86
2) Mayahara H, Fukimoto K, Ogawa K：A new onestep method for the cytochemical localozation of ouabain-sensitive, potassium-dependant, p-nitrophenylpho-sphatase activity. Histochemistry. 1980；67：125-138
3) Murphy ED, Roths JB：Autoimmunity and lymphop-roliferation：induction by mutant gene lpr, and acceleration by a male associated factor in strain BXSB mice. In：Rose NR, Bigazzi PE, Werner NL(eds) Genetic Control of Autoimmune Disease, pp209-220. Amsteredam/New York：Elsevier-North Holland, 1979
4) Cohen PL, Eisebberg RA：Lpr and gld：single gene models of systemic autoimmunity and lymphoproliferative disease. Ann Rev Immunol. 1991；9：242-269
5) Stephen SDG, Luxon L, Hinchcliffe R：Immunological disorders and auditory lesion. Audiology. 1982 ；21：128-148
6) Trune DR, Craven JP, Morton JI, Mitchell G：Autommuine disease and cochlear pathology in the CH/lpr starin mouse. Hearing Res. 1989；38：57-66
7) McCabe BF：Auto-immune sensorineral hearing loss. Ann Otol Laryngol. 1979；88：585-590
8) Kanzaki J, Uichi O：Circulating immune complexs in steroid response sensorineural hearing loss. Laryngoscope. 1984；94：664-666
9) Moskowits D, Lee KJ. Smith HW：Steroid use in idiopathic sudden sensorineural hearing loss. Laryngoscope. 1984；94：664-666
10) Koizumi T, Nakao Y, Matsui T, et al：Effects of corticosteroids and 1.24R-ddyhydrxy-vitamin D3 administration on lymphoproliferation and autoimmune disease in MRL/MP-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Imunol. 1985；77：396-404
11) Rarey KE. Tyneway D. Patterson K：Decreased adenosine triphosphatase activity in the absence of adrenocorticosteroids. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 1989；115：817-821
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