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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(11): 1546-1553. |
| Histologic Similarity between the Primary Tumor and Xenograft of AMC-HN Cell Lines in Nude Mice. |
| Hyung Kyung Jun, Sang Yoon Kim, Gyung Yub Gong |
1Department of Otorhinolaryngology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, Seoul, Korea.
2Department of Pathology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, Seoul, Korea. |
| 누드 마우스에 이식시킨 AMC-HN 세포주의 종양과 원발암과의 조직학적 유사성 |
| 전형경1 · 김상윤1 · 공경엽2 |
| 울산대학교 의과대학 서울중앙병원 이비인후과학교실1;진단병리학교실2; |
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| ABSTRACT |
BACKGROUND:
Head and neck cancer(HNC) is the sixth most common cancer worldwide. Squamous cell carcinoma(SCC) accounts for 85-90% of all HNC. However, its biologic behavior has little been known yet.
OBJECTIVES:
In the present investigation, Eight of nine cell lines, which were developed and characterized in Asan Medical Center of University of Ulsan, were tested for tumor formation and histology in nude mice.
MATERIALS AND METHODS:
Explant cultures of fresh tumor tissue were used to develop new permanent tumor cell lines.
Five-to ten million-cells were injected subcutaneously into 3-to 6-week-old male nude mice and the formation of tumors was evaluated after 3 to 8 weeks.
RESULTS:
Eight cell lines(AMC-HN-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7 and -9) produced progressively growing tumor, and were noticed remarkable similarity of the histologic feature to original tumor. Well formed keratin pearls were present both in the original tumor and the tumor produced by the AMC-HN-3 and -7 cell lines. AMC-HN-2 and -6 grew in well formed infiltrating cords with a prominent stromal network exactly like that in the original tumor. The undifferentiated carcinoma from AMC-HN-9 has the same histologic and immunohistochemical pattern.
CONCLUSION:
The histologic similarity between original tumors and AMC-HN cell lines are representative that cell lines are promised to be good in vitro models for study of HNC biology. |
| Keywords:
Squamous cell carcinoma cell lineㆍNude mouseㆍHistology |
서론
우리나라를 포함한 아시아 지역에서는 두경부암의 발생 빈도가 높다.1) 이러한 두경부암의 생물학적 특성을 연구하기 위해서는 세포주 확립이 필요하나 두경부암에서의 세포주의 확립은 기술적으로 어려워 1980년대 초부터 소수의 보고가 있을 뿐이다.2)3)4) 우리나라에서는 김 등5)이 두경부암 환자에서 9개의 새로운 세포주를 확립하여 그 특성을 보고한 바 있다. 하지만 어렵게 확립된 세포주라고 할지라도 그 세포주가 원발암의 성질을 대표한다고 단정하기에는 문제점이 있다. 그러므로 세포주 확립 과정에 있어 세포주가 원발암의 성질을 대표하는 가에 대한 검증 작업은 필수적이다. 대표적인 검증 방법으로 nude mice에 종양세포를 이식하여 biologic activity와 조직학적 특성을 원발암과 비교함으로써 유사성을 검증할 수 있다.6)7)
본 연구의 목적은 확립된 세포주를 누드 마우스에 이식하여 형성된 종양과 환자에게서 얻어진 원발암의 조직학적 특징을 비교함으로써 암세포주가 원발 종양의 특성을 보전하고 있는 지를 검증해 보고자 하였다.
대상 및 방법
1. 세포주 확립 및 유지
1993년 1월부터 1994년 3월까지 서울중앙병원 이비인후과를 방문한 환자중 두경부암으로 진단되어진 환자 81명을 대상으로 세포주 확립을 위하여 종양 조직을 채취하였다. 조직 채취는 환자의 조직을 확진하고자 시행된 조직 생검 또는 치료적 목적으로 시행된 수술적 적출술 이후 얻어진 환자의 조직 절편을 이용하였다. 배양이 실시된 환자의 조직은 종양의 원발 부위뿐만 아니라 경부 임파절에서 얻기도 하였다. 얻어진 조직 절편은 얻어진 즉시 혈청이 들어있지 않은 transport media에 담아 실험실로 운반하였다. 실험실로 운반된 조직은 깨끗이 처리한 후 1mm 3 정도의 크기로 잘게 자른 다음 이를 T25 flask에 적절히 붙여 배지를 넣고 CO2 incubator에서 세포 배양을 시작하였다.8) 일차 배양후 세포가 많이 자라면 계대 배양을 하였다. 배지를 갈아줄 때 과도하게 자라는 fibroblast를 제거하기 위해 trypsin처리를 하였다.
세포 배양은 1% nonessential amino acid와 2mM L-glutamine, 10% fetal bovine serum(FBS)이 들어있는 Eagle’s minimum essential medium(MEM)(Gibco, Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)을 이용하였고, 5% CO2와 습도가 유지된 37℃에서 배양하였다. 배양 도중 mycoplasma 감염이 의심되는 4례의 세포주는 BM-Cyclin(Boehriger Mannheim, Indianapolis, IN)을 3회에 걸쳐 투여하였고 재검사 후 이상이 없음을 확인하였다. 계대 배양후 새로이 분주하고 남은 세포는 액체 질소에 동결 보존하였다.
2. Tumorigenicity in vivo(Fig. 1)
9개의 세포주 중 8개의 세포주를 trypsin 처리와 세척을 하여 부유상태에서 5×10 6에서 1×10 7개의 세포를 3∼6주된 수컷 누드 마우스(Asan Institute for Life science, Seoul, Korea)에 피하 접종하여 3∼8주후 종양 형성을 확인 하였다.
3. 조직 염색
누드 마우스를 전신마취한 후 종양을 각각 절제하였고 수술후 누드 마우스는 희생시켰다. 적출된 종양은 모두 10% formalin에 고정하여 파라핀 포매후 hematoxylin과 eosin 염색을 시행 하였고, AMC-HN-9 세포주에서는 cytokeratin(low molecular weight & high molecular weight), S-100, EMA(epithelial membrane antigen) 등의 면역조직화학염색(immunohistochemical staining)을 병행하여 환자에게서 얻어진 조직의 염색 소견과 비교하였다. AMC-HN-8 세포주는 누드 마우스에 이식하는 실험을 시행하지 않았다.
결과
1. 대상 환자(Table 1)
세포주를 얻어낸 환자군의 연령은 46세에서 67세였으며, 7명이 남자였고 2명이 여자였다. 부위로는 구강암이 3례, 후두암이 3례, 하인두, 비강, 이하선 암이 각각 1례였다. T stage로 분류하였을 때 T4가 5례였고 T3가 3례, T1이 1례였다. N stage로 분류하면 N0가 3례, N1이 1례, N2가 5례였다. 편평 상피 세포암 환자중에는 well differentiated carcinoma가 3례, moderately differentiated carcinoma가 5례였다. Patient 9는 이하선암 환자로 면역조직화학적 진단을 포함한 여러 가지 병리 진단에 의해서도 기원세포를 밝혀내지 못하여 단지 undifferentiated carcinoma로만 진단되었다.
AMC-HN-1, -3, -6과 -9는 방사선 치료, 항암제 치료 또는 이전에 수술을 받지 않은 환자에게서 얻어진 세포주들이다. AMC-HN-8과 -9는 임파절 전이 부위에서 얻어졌다. AMC-HN-2, -4, -5, -7은 이전에 방사선 치료나 항암제 치료 혹은 수술을 받았으나 재발된 환자에게서 확립된 세포주들로 조직은 모두 구제수술을 통해 얻어졌다. 세포주를 공여한 환자의 7명이 원격 전이 등에 의해 수술후 2년 이내에 사망하였으며 2명만이 병의 재발이 없었다.
2. 세포주 배양 형태(Table 2, Fig. 2)
AMC-HN-1, -2와 -5는 상피형 혹은 방추형의 모습을 띤 세포가 배양되었으며 상대적으로 세포간 접촉이 약했고, 배양되면서 공처럼 둥근 모양을 형성하였고 trypsin처리시 배양 플라스크 바닥에서 쉽게 떨어졌다. AMC-HN-3, -4, -6, -7, -8의 세포들은 상피형의 모습이었으며 세포간 접촉이 긴밀하여 trypsin처리에도 불구하고 잘 떨어지지 않았다. 이중 AMC-HN-3, -4, -7, -8들은 단층으로 배양되었으며 AMC-HN-6은 중층(stratification) 배양되는 성질을 가지고 있었다. AMC-HN-9은 대부분 방추형 세포로 구성되어 있었고, 세포의 모습이 confluent함에도 불구하고 세포간 접촉이 적었으며 플라스크 바닥에서도 쉽게 분리되었다.
3. 조직 발현 양상(Fig. 3)
세포주에 의해 누드 마우스에서 적출한 종양 조직의 H & E 염색 소견과 환자 조직의 소견은 매우 유사한 결과를 보였다. 환자 4와 그 환자에게서 얻어진 세포주 AMC-HN-4, 환자 7과 그 세포주인 AMC-HN-7에서는 모두 잘 발달된 keratin pearl형성을 볼 수 있었으며, 환자 1과 세포주 AMC-HN-1에서는 그보다는 약간 적은 양의 keratin pearl이 관찰되었다. AMC-HN-2, -3, -5, -6에서는 환자의 원발 종양에서와 같이 keratin pearl이 잘 발달되어 있지 않았으며, AMC-HN-9 에서도 keratin pearl이 관찰되지 않았다. AMC-HN-2와 AMC-HN-6에서는 원발 종양의 조직에서도 관찰된 stromal network형성이 잘 나타났다(Table 3). AMC-HN-9에서는 면역조직화학 염색을 시행하여 원발 종양에서처럼 low molecular weight cytokeratin에서만 양성 염색이 되었고 나머지 high molecular weight cytokeratin, S-100, EMA 등에서는 음성 반응을 보였다(Table 4).
고찰
일반적으로 두경부 편평상피암 세포주는 배양이 어려워 세포주 확립이 어렵다. 또한 세포주 확립에 성공한 경우는 대부분 그 원발 세포가 재발 내지는 원격 전이, 혹은 암이 진행된 환자에게서 얻어지는 것이 대부분이다.8) 저자들은 세포주 확립을 위한 환자 조직 배양을 81례에서 시도하여 그 중 9례에서 세포 배양에 성공하였다. 이처럼 세포주 배양에 많은 실패를 한 이유는 fibroblast의 과잉 증식과 이를 잘 제거할 수 있는 배양 기술의 부족이 가장 큰 이유가 아니었을까 생각된다. 한편 Krause등3)은 2년동안 대부분이 편평 상피암이었던 환자 194명의 조직을 이용하여 편평상피암 세포주를 확립하고자 하였으나 단지 3례에서만 성공하였음을 보고하였다. 그는 세포 배양 실패의 가장 흔한 요인으로 부적절한 영양 공급을 들었으며 contamination과 fibroblast 과잉성장에 의한 세포주 성장 장애를 제시하였다. 배양에 성공된 세포주를 제공한 대부분의 환자는 진행된 병에 의하여 사망하였다(Table 1). 이러한 사실로 보아 세포주 배양에 성공한 세포는 실패한 세포에 비해 임상적으로 보다 예후가 좋지 않으며 침습성이 강할 것이라고 추측할 수 있었다.
AMC-HN-9을 제외한 나머지 세포주의 배양되는 모습은 상피형을 띠어 세포의 기원이 상피 세포임을 시사하였다. AMC-HN-4, -7, -8 세포주들은 비교적 세포간 접촉이 좋고 trypsin 처리를 하였음에도 플라스크에서 잘 떨어지지 않았다. 이 세포주들은 원발 종양 및 누드 마우스에서 모두 분화도가 좋았는데 세포 배양시 배양 플라스크에 잘 붙는 세포주는 원발 종양에서 분화도가 좋을 것으로 생각된다.
계대 배양후 확립된 세포주가 원발 종양의 성질을 변함없이 대표할 수 있는 지의 여부에는 여러가지 의문점이 제시되어왔다. 가장 대표적인 것은 세포주가 monoclonal하게 배양되므로 복합적인 성질을 띤 세포들로 이루어진 원발 종양과는 차이가 있으리라는 것이다. 그러므로 원발 종양과의 차이를 알아보기 위한 실험적 규명이 필요하고, 그 중 대표적인 것이 in vitro에서 세포 핵형(karyotype)의 차이를 보는 것9)10)11)과 in vivo로 동물 모델을 이용하여 원발 종양과의 조직학적 유사성을 알아보는 것12)이다. 핵형 분석은 아직도 초보적인 단계이고 특징적인 핵형도 알려져 있지 않다. Sacks등11)이 8개의 두경부 편평 상피암 세포주의 핵형 분석을 하여 염색체 1번의 변성을 보고하였고, Heo등10)은 편평 상피암 세포주 일부에서 암유전자(oncogene) 인 c-raf-1이 있는 염색체 3번의 short arm의 결손을 발견하여 주목을 받고 있다.
동물 모델을 이용하여 두경부암 세포주를 성공적으로 확립한 예는 드물며 원발 종양과 다르다고 보고한 예도 적지 않다. 누드 마우스는 실험 동물 모델로 가장 많이 이용되는 동물이다. Heo등10)이 편평 상피암 세포주를 누드 마우스에 주입하여 배양한 종양 조직으로 원발 종양의 조직을 비교하여 분화도 정도, 단핵구 침윤 정도, keratinization 등이 매우 유사하다는 보고를 하여 배양된 그가 배양한 편평 상피암 세포주가 원발 종양을 대표할 수 있을 것이라고 발표하였다. 우리가 시행한 이번 실험에서도 환자의 원발 종양과 세포주를 누드 마우스에 이식하여 형성시킨 종양은 조직학적으로 매우 유사하였다(Table 3). Keratin pearl 형성의 발현 여부는 물론 AMC-HN-2와 -6에서 보인 stromal network 형성이 각각의 세포주를 제공한 환자 원발 종양에서 보이던 모습과 같다는 것은 우리가 배양한 세포주가 원발 종양과 biologic behavior를 같이한다고 유추할 수 있겠다. 누드 마우스는 영국의 Glasgow에 있는 Ruchill Hospital의 albino mouse에서 발견된 mutant로13) 생물학적 특성은 무모(hairless)와 선천적으로 흉선이 없다는 점이며, 선천적으로 T-cell의 기능을 가지고 있지 않기 때문에 면역학 연구에 유용한 것으로 알려져있다. 또한 인간 암세포의 이식이 가능하기 때문에 인간 암세포 특성의 검색, 암세포주의 유지, 항암제의 screening test 등에 유용하다.6)7)13)
환자 9에서 얻어진 조직은 이하선 종물에서 얻어진 것으로 수술 후 조직 진단이 어려웠으나, 여러가지 특수 면역조직 염색을 통하여 undifferentiated carcinoma로 밝혀졌다. 환자 세포에 의해 확립된 세포주에서도 생체내 조직학적 특징이 같은 지를 알아보기 위하여 AMC-HN-9 세포주로 마우스에서 종양을 유발시켜 원발 종양과 같은 특수 면역조직 염색을 시행하였다. 그 결과 중배엽 기원의 종양과 흑색종을 잘 염색시키는 S-10014)에는 염색되지 않았으나, low molecular weight cytokeratin에는 잘 염색되었다. High molecular weight cytokeratin과 EMA(epithelial membrane antigen)에는 염색이 되지 않았다. 일반적으로 low moleular weight cytokeratin은 편평 상피 세포가 아닌 다른 상피 세포에서 유래되는 선암(adenocarcinoma) 및 분비관 암(ductal carcinoma) 등에 잘 염색되며 편평 상피 세포에는 염색이 잘 되지 않는 것으로 알려져 있다.15) High molecular weight cytokeratin은 편평 상피 세포에 포함된 cytokeratin 1, 5, 10, 14 등에 반응하여 염색되며 EMA는 정상 상피 세포를 비롯한 상피암 등에 잘 염색된다.16) 이처럼 환자 9가 원발 종양 조직과 세포주 AMC-HN-9에서 low molecular weight cytokeratin에만 염색되고, high molecular weight cytokeratin, EMA, S-100 등에 염색이 되지 않는 것은, 세포주의 기원이 편평 상피가 아니라는 것을 나타낸다. 결국 이 종양은 세포의 기원을 밝혀내지 못하고 분화도가 나쁜 carcinoma로 최종 진단을 내릴 수 밖에 없었다.
원발 종양과 마우스에서의 종양이 조직학적으로 유사하다고는 하지만 임상적으로 환자 예후를 결정하는 암세포의 침윤이나 전이 능력 등을 실험 동물에서 모두 검증할 수는 없다.17)18) 그러므로 세포주를 이용한 연구에는 이러한 생체내 반응(biologic activity)을 반영할 수 있는 모델이 필요하고, 이를 위해 종양이 인간의 생체내에서 반응을 일으킬 때 필요한 혈청학적 요소들의 대한 연구가 요구된다. 원발 종양이 일으키는 생체내 반응과 똑같이 세포주가 동물 모델에서 생체내 반응을 일으킨다는 점을 증명할 수 있다면 세포주를 통한 연구로써 종양의 생물학적 기전을 밝히고 종양 치료에 대한 연구에 더욱 큰 역할을 할 수 있을 것으로 사료된다.
결론
Explant 기법을 이용하여 두경부암 세포주 9례를 성공적으로 확립할 수 있었다. 이중 8례는 편평 상피암 세포주이며 1례는 이하선에서 유래된 undifferentiated carcinoma 세포주였다. 편평 상피암 세포주 7개와 undifferentiated carcinoma 세포주 1개를 누드 마우스에 접종 후 종양 발현에 성공하였으며 그 조직학적 발현 양상은 원발 종양과 매우 유사함을 밝혔다. 누드 마우스를 이용하여 확립된 세포주는 원발 종양의 조직학적 특성을 보전하고 있다고 생각되며 이 세포주를 이용하여 향후 암세포 연구에 기여할 수 있겠다.
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