| Significance of p53 Mutation and Expression of Rb, MIB1 in Laryngeal Squamous Cell Carcinoma. |
| Jong Ouck Choi, Jung Soo Park, Yong Hoan Kim, Geon Choi |
| Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea. KUENT@Nuri.net |
| 후두암종에서 <i>p53</i> 유전자 변이 및 Rb유전자 단백과 MIB1의 발현양상 |
| 박종욱 · 박정수 · 김용환 · 최 건 |
| 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 |
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| 주제어:
후두편평세포암종ㆍp53ㆍRbㆍMIB1. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Treatment results of laryngeal carcinoma may depend on the microscopic environment of the primary lesion. If there is an abundance of lymphatic channels, the laryngeal lesion is more likely to develop frequent cervical metastases, leading to treatment failure.
Prognosis of the laryngeal carcinoma is usually determined by clinical staging. However, it does not account for the oncobiological characteristics and microscopic environments.
The importance of biological markers including p53, Rb and MIB1 as a prognostic factor has yet to be determined. To determine the relationship between the prognosis and biological characteristics of p53, Rb, and MIB1 in laryngeal cancers.
MATERIALS AND METHODS:
Thirty seven laryngeal carcinoma specimens were studied for p53 gene mutation by PCR-SSCP and expression pattern of Rb and MIB1 proteins by immunohistochemistry.
RESULTS:
p53 gene mutation was found in 32.4% with nine cases in exon 5, two cases in exon 7, and two cases in exon 8, respectively. Higher incidence of p53 gene mutation was found in supraglottic cancer (p>0.05). Negative expression rate for Rb was 29.7% and positive MIB1 expression rate was 32.4%. There was no significant correlation between the treatment success and p53 gene mutation, expression pattern of Rb and MIB1 gene.
CONCLUSION:
p53 gene mutation and expression pattern of both Rb and MIB1 showed little value as a prognostic factor.
However, in cases where p53 and Rb tumor suppressor gene mutation were found in combination, the prognosis was poor.
In this regard, such marker might be used as one of the important biological prognostic factors. |
| Keywords:
p53ㆍRbㆍMIB1ㆍLaryngeal squamous cell carcinoma |
서론
종양은 다단계의 유전자 변이에 의하여 형성되며, 병변의 진행과정에서 주위조직으로의 침습과 전이가 자주 발생하기 때문에 효과적인 치료에 어려움이 많다.
후두 편평세포암종은 국소성이 높지만 침습도와 원발병소의 미세환경에 따라 림프조직의 분포가 풍부하면 경부전이를 초래하여 치료와 예후 판정에 어려움이 있다. 후두암종의 치료지침과 예후 판정은 주로 임상적 병기가 이용되고 있으나 종양의 생물학적 특성과 미세 환경의 차이를 반영하기에는 미흡하므로 종양세포의 생물학적 특성을 파악하는 것은 중요한 역할을 한다.1)
이러한 종양생물학적 특성을 반영하는 p53 변이, MIB1의 발현, 망막아세포종유전자(Rb gene：retinoblastoma gene) 등의 단백 변화는 세포증식의 조절 실패로 종양발생을 유발하는 것으로 보고되고 있으며, 특히 p53과 Rb 유전자 복합변이는 종양의 공격적 성향을 반영하는 지표로서의 가능성이 제시되고 있다.2-4)
따라서 이 연구는 후두암종에서 종양억제 유전자인 p53 변이 및 Rb 단백 변화, 증식능을 반영하는 MIB1 표현양상의 상관관계를 규명함으로써 후두암종의 종양생물학적 특성과 예후와의 관계를 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
대상
연구대상은 1990년 7월부터 1995년 6월까지 5년간 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실에서 후두 편평세포암종으로 진단받은 환자 중 수술적 치료를 우선적으로 시행하였던 환자로서 수술시 적출한 종양의 파라핀 포매조직의 처치 및 보관 상태가 양호하였던 37례를 대상으로 하였다.
대상 예의 남녀비는 33：4이었으며, 연령분포는 36세부터 74세로 평균연령 63.5세이었다. 평균 추적관찰기간은 34.6개월이었으며(Table 1), 무병생존 24례, 치료에 실패하였던 유병생존 3례, 유병사망 10례이었다.
원발부위는 성문상부암종 18례, 성문암종 19례이었으며, 병리조직학적 병기(pTNM, AJCC, 1997)에 따른 T 병기는 T1병기 4례, T2병기 10례, T3병기 9례, T4병기 14례이었으며, N병기는 N0병기 26례, N1병기 3례, N2병기 8례이었다. 임상병기는 제 1 기 4례, 제 2 기 10례, 제 3 기 9례, 제 4 기는 14례이었다(Table 2).
방법
재 료
수술시 적출된 조직의 hematoxylin-eosin 염색표본을 검토하여 종양이 포함된 파라핀 포매 조직의 보관 상태가 양호한 부위를 선택하였다. p53 유전자 변이를 검출하기 위하여 5~10 μm 두께의 파라핀 포매 조직절편 2~3개를 취하여 xylene을 가하여 파라핀을 제거하고 에탄올을 가하여 남아 있는 xylene을 세척한 후 진공건조기에서 완전 건조시킨 후 Genome DNA Isolation Kit(Bio 101)를 사용하여 DNA를 분리하였다.
세포에서 DNA 분리
Lysis buffer 0.9 ml, RNase 25 μl, cell denaturing buffer 50 μl를 가하여 15분간 55℃에서 반응시킨 다음, protease mix 25 μl를 가하여 55℃에서 하루밤 동안 반응시켰다. Salt-out mixture 250 μl를 가해 salting out시킨 후 상층액에 100% 에탄올 6 ml을 가하여 1,500 rpm에서 15분간 원심분리하여 얻은 DNA pellet을 살짝 말린 후, TE buffer(10 mM Tris, 1 mM EDTA) 50 μl에 녹인 후 spectrophotometer로 DNA 농도를 측정한 다음 영하 20℃에 보관하였다.
p53 유전자 변이의 검출
p53 유전자에 대한 변이여부는 PCR-SSCP(polymerase chain reaction-single strand conformational polymorphism) 방법으로 조사하였다.
PCR
p53 유전자의 exon 5, exon 6, exon 7, exon 8에 대하여 증폭시킬 각 DNA 400 ng, 0.2 mM dNTP, 10x buffer, 10pmols/μl primer, 1.25U Taq polymerase 및 10 μM의 primers를 가하여 25 μl 되게 한 후, PCR thermal cycler(Perkin Elmer 2400)을 사용하여 94℃에서 40초, 53℃에서 40초, 72℃에서 40초간의 반응을 40회 반복하였다(단, exon 6의 anealing 온도：57℃). 증폭된 PCR 산물은 1.5% agarose gel 전기영동으로 확인하였으며 각 primers에 대한 유전자 서열 및 예상크기는 다음과 같다.
p53
exon 5
forward ：5' TACTCCCCTGCCCTCAACAA 3'
reverse ：5' CATCGCTATCTGAGCAGCGC 3'
178 bp
exon 6
forward ：5' GCTTGGCCCCTCCTCAGCAT 3'
reverse ：5' CTCAGGCGGCTCATAGGGCA 3'
114 bp
exon 7
forward ：5' TCTGACTGTACCACCATCCA 3'
reverse ：5' CTGGAGTCTTCCAGTGTGAT 3'
105 bp
exon 8
forward ：5' TGGTAATCTACTGGGACGGA 3'
reverse ：5' CGGAGATTCTCTTCCTCTGT 3'
86 bp
SSCP로 p53 유전자 변이조사
PCR 산물을 10 μl를 취해 boiling하여 denaturation시킨 후, 얼음으로 급히 냉각시킨 다음, 12% polyacrylamide gel에서 200 V로 15시간 전기영동 후 gel은 10% 에탄올로 10분간 고정시켰다. silver staining 방법으로 DNA single band pattern을 확인하였는데, 먼저 gel을 1% nitric acid에서 3분간 담근 다음 증류수 100 ml를 가하여 세척하였다. 다시 0.2% silver nitrate 용액에서 20분간 반응시킨 후, 발색용액(0.28 M sodium carbonate, 0.019% formaldehyde)에서 band가 뚜렷이 보일 때까지 반응시킨 후 10% glacial acetic acid로 반응을 중지시켰다. 양성대조군으로 정상인의 혈구세포에서 분리한 DNA에 대해 p53에 대한 PCR을 시행하고 SSCP band 양상을 비교하여 유전자변이 여부를 검색하였다(Fig. 1).
Rb와 MIB1의 면역조직화학적 염색
10% 중성 포르말린 고정과 통상적인 파라핀 포매를 거친 조직을 4 μm 두께의 연속절편을 만들어 gelatin으로 처리한 슬라이드에 부착하여 한 절편은 hematoxyline-eosin염색을 다시하여 종양세포를 확인하였다. 다른 절편들은 상품화된 kit를 이용한 일반적인 ABC(avidin biotin complex peroxidase)법으로 염색하였다.
일차항체
Rb에 대한 항체는 토끼 다클론항체 Rb(C-15)(Santa Cruz Biotech, USA)를 1：100으로 희석하여 사용하였고, MIB1에 대한 면역조직화학적 염색은 MIB1단클론항체(Dianova Co, Germany)를 1：100으로 희석하여 사용하였다.
면역조직화학적 염색
파라핀 절편을 56℃에서 30분간 처리하고 xylene으로 약 10분간 3회 탈파라핀 후 100%, 90%, 80%, 70% 에탄올로 처리하여 함수시켰다. MIB1에 대하여는 트립신 처리 후 극초단파(microwave) 오븐에 5분간 2회 넣어두었다. 내인성 과산화효소의 활성을 억제시키기 위하여 0.3% hydrogen peroxidase로 5분간 처리 후 0.05 M Tris-HCl buffer(pH 7.6)으로 10분간 3회 세척하였다. 일차 또는 이차 항체의 비특이적 결합을 억제시키기 위하여 정상 염소혈청으로 5분간 처리 후 0.05 M Tris-HCl buffer로 수세하였다. 일차항체와 반응을 24시간 시키고, 3회 세척하였으며, biotinylated anti-rabbit, anti-mouse immunoglo-bulin을 10분간 반응시켰다. Tris 완충액으로 세척한 후 streptavidin과 반응시키고 DAB(3, 3'-diaminobenzidine tetrachloride)으로 발색반응을 하였으며, 대조염색은 Meyers hematoxylin으로 하였다. 음성대조군으로는 일차항체를 처리하지 않고 항체희석에 사용하였던 PBS buffer로 대치하여 같은 절차로 염색하였으며 양성대조군으로 Rb는 정상 후두조직을 사용하였다.
염색의 판정
Rb는 세포핵내 담갈색의 과립이 보이는 것을 양성으로 판정하였는데, 정상 후두조직의 선조직, 혈관내피, 기저부를 제외한 점막에서 양성반응을 보였으며, 종양세포의 주변부에서 염색이 되지 않은 경우를 음성으로 판정하였다(Fig. 2). MIB1에 대한 판정은 400배 배율로 관찰하여 가장 진하게 염색된 10개 내외의 시야를 찾아 1,000개의 세포 중 염색된 세포핵에서 황갈색 과립이 30%미만인 경우는 음성, 30% 이상인 경우는 양성으로 판정하였다(Fig. 3).
통계 분석
결과는 후두암종의 원발부위, 임상적병기, 치료결과 등에 따른 p53 유전자 변이와 Rb, MIB1의 표현양상에 대하여 분석하였다. 생존율은 5년간 추적관찰이 가능하였던 대상만을 Kaplan-Meier method로 계측하였다. 통계분석은 chi-square 검정법을 사용하였으며 유의성은 0.05미만으로 정하였다.
결과
후두암종에서 p53 유전자 변이 양상
p53 유전자 변이는 37례 중 exon 5, 9례(성문상부암종 5례, 성문암종 4례), exon 7, 2례(성문암종, 성문상부암종 각 1례), exon 8, 2례(성문암종, 성문상부암종 각 1례)이었으며, 성문상부암종 1례에서는 exon 5와 8에 동시에 변이가 있었다. 성문상부암종 7례(38.9%), 성문암종 5례(26.3%)로 성문상부암종이 성문암종보다 높았으나 유의한 차이는 없었다.
후두암종에서 Rb의 발현양상
Rb 음성은 성문상부암종 7례(38.9%), 성문암종 4례(21.1%)이었으며, 원발부위에 따른 Rb 음성표현율은 유의한 차이가 없었다.
후두암종에서 MIB1의 발현양상
종양세포의 증식능을 반영하는 MIB1 발현은 성문상부암종에서 음성은 11례(61.1%), 양성은 7례(38.9%)이었으며, 성문암종에서 음성은 14례(73.7%), 양성은 5례(26.3%)로 MIB1의 발현양상은 원발부위에 따라 유의한 차이가 없었다.
치료결과와 p53 유전자 변이, Rb, MIB1 발현양상과의 관계(Table 3)
37례의 치료 후 추적관찰기간 중 무병생존 27례(73%), 치료에 실패한 유병생존은 3례(8.1%), 유병사망은 7례(18.9%)이었다.
p53 유전자 변이가 있었던 경우 무병생존 7례(25.9%), 치료에 실패한 유병생존 2례(66.7%), 유병사망 3례(42.9%)이었고 p53 유전자 변이가 없었던 경우 무병생존 20례(74.1%), 유병생존 1례(33.3%), 유병사망 4례(57.1%)이었다. Rb 음성은 무병생존 6례(22.2%), 유병생존 1례(33.3%), 유병사망 4례(57.1%)로 유전자 변화율은 치료에 실패하였던 유병사망 예에서 높았으나 유의한 차이는 없었다. MIB1 양성은 무병생존 10례(37.0%), 유병생존 1례(33.3%), 유병사망 1례(14.3%)이었다.
p53, Rb 종양억제유전자 복합유전자 이상과 예후와의 관계(Table 4)
p53과 Rb의 복합유전자 이상이 있었던 7례 중 무병생존 3례, 치료에 실패한 유병생존 1례, 유병사망 3례로 유의한 차이가 있었다(p<0.05). 종양억제 유전자 단일변이를 보였거나 변이가 없었던 대상은 각각 9례와 21례이었다.
고찰
후두암종은 세포의 과성장을 억제하는 종양억제 유전자의 변이, 전구암 유전자의 암유전자로의 전환 등에 의하여 발생한다. 두경부암의 예후에 관여하는 요인으로는 종양의 크기, 침범정도, 림프절전이, 원격전이를 평가한 임상적 병기와 원발병소에 통하여 결정할 수 있다. 그러나 같은 병기라도 종양세포의 생물학적 특성과 미세환경 차이와 발생부위에 따라 임상적 경과와 예후가 다르므로 종양세포의 생물학적 특성을 파악하는 것이 중요하다.1) 이러한 종양세포의 특성은 종양억제 유전자의 변이와 단백산물, 종양유전자와 세포증식능을 파악함으로써 규명하고자 하는 연구가 이루어지고 있다.2-4)
p53 유전자는 종양억제 유전자의 하나로 세포주기와 전사의 조절 및 세포분화를 조절하여 정상적인 세포증식을 조절하는 기능을 갖고 있으며, 비정상적인 세포증식을 억제하는 역할을 한다.2) p53 유전자 변이가 발생하면 변이형 p53 단백이 생성되며 정상형 p53 단백의 기능을 불활성화하여 세포의 변이가 일어남으로써 종양발생에 관련된다.5) 후두암종에서 유전자의 변이가 발생하는 부위는 p53 유전자에 존재하는 11개 exon중 5, 6, 7, 8에서 주로 발생한다.6)
저자의 연구에서는 p53 유전자 exon 5, 6, 7, 8에 대하여 PCR-SSCP방법으로 관찰한 결과 변이율이 32.4%이었으며, 37례 중 exon 5의 변이는 9례, exon 7은 2례, exon 8은 2례이었다. 1례는 exon 5와 8에서 복합유전자 이상이 있었으나, exon 6에 대한 변이는 없었다. 전례에서 exon 5, 6, 7, 8에 대하여 PCR을 시행한 결과, 전례에서 1개 이상의 exon에 대하여 PCR산물을 관찰하였으나 4개의 exon에 대하여 모두 PCR 산물을 관찰한 예는 29례이었다.
Gasparini 등7)은 p53 단백에 대한 면역조직화학적 방법으로 두경부암 70례를 분석한 결과 전이가 있었던 예에서 p53 과표현이 의미있게 증가하였으며, Gleich8)의 실험에서는 p53과 환자의 예후와 의미있는 관계가 있어, 예후인자로 이용할 수 있다고 보고하였다.
저자의 결과에서는 p53 유전자 변이율이 경부 전이가 없었던 경우 29.6%, 경부 전이가 있었던 예에서는 45.5%로 경부 전이군에서 높았으나 통계학적 유의성은 없었다. 치료결과에 따른 p53 변이율은 유병사망군에서 50.0%, 무병생존군에서 25.9%로 차이는 있었으나 유의성은 없었다.
망막아세포종유전자(Rb)는 암 억제유전자로 13번 염색체의 장완에 위치하며, 이 유전자의 단백산물은 110 kD의 인단백으로 정상조직의 세포핵에 존재한다.9) Rb단백의 기능 상실은 Rb 유전자의 변이, 바이러스성 종양단백과 결합한 경우, Cyclin D1 단백의 과표현에 의하여 Rb단백의 인산화가 발생한 경우에 일어난다고 알려져 있다.10) Rb 단백의 변화는 성문상부암종, 식도암종 등 상부호흡기의 암종에서 관찰되며, 이러한 변화는 Cyclin D1과 관련되며, 예후와 관련이 있는 것으로 보고되어 있다.11)
Gleich 등8)이 두경부암에서 p53과 Rb 유전자 변이가 동시에 있었던 경우 종양의 공격성이 심하여 불량한 예후를 보이므로 양자의 유전자의 변이를 예후인자로 사용할 수 있다고 하였다. 이 연구에서도 Rb단백의 발현양상과 치료결과는 유의한 차이가 없었으나, p53 유전자변이와 Rb 단백의 변화가 동시에 있었던 경우에는 유의하게 유병사망율이 높았으므로, 종양억제 유전자가 동시에 변화가 있는 예에 대하여는 적극적인 치료가 필요하며, 예후인자로 이용할 수 있을 것으로 생각된다.
악성종양의 증식정도는 종양의 악성도를 반영할 수 있으므로 MIB1의 양성 핵면적율이 높을수록 비배수성인 예가 많고, 비배수성인 종양에서 조기재발 및 생존율의 감소와 관계가 있다. 침윤성암종에서 경계 상피세포와 간질의 MIB1 양성 핵면적율의 정도가 예후와 유의한 상관관계가 있다고 알려져 있다.12)
Eckel 등13)은 조기 후두암의 치료 후 재발과 MIB1발현은 유의한 관계가 있었으며, 재발된 군에서 MIB1의 지수가 재발되지 않은 군보다 2배 이상 높았다고 보고하였다. 두경부암에서 MIB1의 양성율은 병리조직학적 분화도와 관련이 있는데 분화도가 나쁠수록 증식지수가 높고, p53 유전자 변이가 함께 있는 경우에 불량한 예후를 보인다는 연구도 있다.14)
저자의 실험에서는 MIB1이 양성으로 표현되면 분화도가 나쁠수록 유의하게 증가하는 것을 관찰하였으나, 예후와는 상관관계가 없었고, p53 유전자 변이율과도 연관성은 없었다.
이상에서 종양억제 유전자인 p53의 변이와 Rb단백의 변화는 종양의 원발부위, 경부림프절 전이, 종양의 임상적 병기, 치료결과와는 차이를 관찰하였지만, 통계학적인 유의성은 없었다. 그러나 p53 변이와 Rb단백의 변화에 의한 음성발현이 동시에 있었던 예에서는 유병사망율이 유의하게 높아 후두암종에서 두가지 종양억제 유전자가 동시에 변화된 경우 불량한 예후를 보이는 것으로 생각된다.
결론
후두암종 환자 37례를 대상으로 종양조직에서 종양억제 유전자인 p53의 변이를 PCR-SSCP로 관찰하였으며, 면역조직화학적 염색으로 Rb유전자 단백과 세포 증식능을 반영하는 MIB1의 발현양상을 치료성적과 비교분석하여 확인하였다.
본 연구결과에서 p53 변이, Rb, MIB1의 발현양상이 각각에 대하여서는 후두암종의 예후인자로서 통계학적인 의미를 부여하기가 어려웠으나, 종양억제유전자의 복합유전자 이상이 있는 경우에는 암종의 예후가 불량하여 중요한 생물학적 예후인자로서 고려할 수 있을 것이라고 제시하는 바이다.
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