| Effect of Platelet-activating Factor on Hearing and Cochlear Hair Cells in Guinea Pigs. |
| Chung Ku Rhee, Yong Ju Jang, Young Hoon Kim, Min Hwan Hyun, Han Gyun Kim, Chan Il Park |
1Department of Otolaryngology, College of Medicine, Dankook University, Cheonan, Korea. yjang@anseo.dankook.ac.kr
2Department of Otolaryngology, College of Medicine, Chungnam University, Taejon, Korea. |
| 기니픽에서 Platelet-activating Factor가 청력과 와우외유모세포에 미치는 영향 |
| 이정구1 · 장용주1 · 김영훈1 · 현민환1 · 김한균1 · 박찬일2 |
| 단국대학교 의과대학 이비인후과학교실1;충남대학교 의과대학 이비인후과학교실2; |
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| 주제어:
PAFㆍ감각신경성난청. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVE: Inflammatory mediators released in the middle ear cavity appear to play an important role in the pathogenesis of otitis media and can cause functional as well as morphological changes in the inner ear. Recent studies have also implicated platelet-activating factor (PAF) to be involved in the pathogenesis of otitis media with effusion in addition to prostaglandines (PGs) and leukotrienes (LTs). PAF appears to be important in the acute inflammatory process of otitis media. The purpose of this study is to determine the effects of PAF placed on round window membrane (RWM) on hearing and cochlear hair cells in guinea pigs.
MATERIALS AND METHODS:
Control group and PAF group received RWM application of phosphate buffered saline (PBS) and PAF 1 ng/ml, respectively. Using auditory brainstem response (ABR), the hearing threshold of both group was measured every 2 hours duirng the 8 hours after placement of PBS or PAF. At the end of the eight hour, the harvested cochlears were prepared for scanning electron microscopy (SEM) study.
RESULTS:
There were mild to moderate increase in the ABR threshold from 2 to 8 hours after the application of PAF on the RWM in PAF group. When the threshold levels of the PAF group and the control group were compared, statistically significant differences were observed between the two groups (p<0.05). In SEM study, both inner and outer hair cells were found to be damaged.
CONCLUSION:
The exogenous PAF-induced hearing loss may have been due to the cochlear hair cell damage caused by these exogenous PAF. Thus, PAF may play an important role in the sensorineural hearing loss in otitis media with effusion. |
| Keywords:
Platelet-activating factorㆍSensorineural hearing loss |
서론
중이강내에 유리된 염증매개물질은 중이염의 병발에 중요한 역할을 하며 내이의 구조적 변화 뿐만 아니라 기능적 변화를 초래할 수 있는 것으로 알려져있다. 이러한 염증매개물질에는 histamine, prostaglandine(PGs), leukotriene(LTs), platelet-activating factor(PAF), kinin, lysosomal enzyme, hydrolytic enzyme, protease등이 있다.1) 최근 연구에서는 PGs와 LTs와 더불어 분비성 중이염의 병인에서 PAF의 역할이 강조되고 있다.2) 이중 PAF, LTB4, LTC4는 중이염의 급성 염증과정에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.1)2)
분비성 중이염, 만성 중이염, 진주종성 만성중이염, 육아종성 중이염 등의 중이 질환이 감각신경성 난청을 유발하나 이러한 감각신경성 난청이 오는 기전은 잘 알려져 있지 않다.3) 그러나 정원창막을 통한 염증매개물 및 세균독소등의 내이로의 투과에 의하여 이러한 감각신경이 올 수 있음이 추정되고 있다. 이에 저자들은 다른 염증매개물질과 마찬가지로20) PAF가 중이에서 와우의 외림프로 투과되어, 와우의 유모세포에 손상을 주어 감각신경성 난청이 유발시킬 수 있는가를 연구하기 위하여 기니픽의 정원창에 PAF를 유치시켜 청력소실 여부를 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
대상군
체중 250∼300g의 건강한 기니픽 16마리를 사용하였다. 실험 시작전 수술현미경 시야에서 중이염이 없음을 확인한 후 무작위로 추출하여 1) 정상대조군 8마리, 2) PAF군 8마리로 나누었다.
청력검사
기니픽의 청력검사는 뇌간유발반응 청력검사로 실시하였다. 장비는 Nicolet Viking IV (Ver. 4.0)를 사용하였다. 실험에 사용한 자극음은 broad band click 음을 사용하였으며, 150 Hz∼3 KHz 대역의 filter를 이용하여 filtering을 시행하였고, 이때 click generation time은 100 μsec이었다. Insert ear phone(Eartone 3A(r))을 사용하였고 numbers of sweep는 평균 500회로 하였다. 음의 강도는 90 dB SPL로 시작하여 10 dB SPL씩 낮추어 가며 측정하여, wave V의 파형이 소실되는 음의 강도를 청력역치로 하였다.
PAF의 투과
실험 전에 청력역치를 측정한 후 기니픽의 bulla의 후하방을 통하여 정원창에 접근하였다. 정상대조군에게는 Phosphate Buffered Saline(PBS) 5 μL를 gelfoam 조각(Upjohn, Kalamazoo, MI)에 묻힌 후 정원창에 놓았고, PAF군의 경우 PAF(Sigma, St. Louis, MO, 1 μg/ml) 5 μL를 gelfoam 조각에 묻힌 후 정원창에 놓았다. 이후 8시간동안 2시간 간격으로 청력검사를 실시하였다.
주사전자현미경 검사
실험을 시작하고 8시간 경과 후, 실험동물을 단두한 후 섭씨 4도, 0.1 M phosphate buffer 2.5% glutaraldehyde로 일차 고정액을 사용하여 외림프강을 관류시키고 otic capsule에 구멍을 내었다. 생체외 관류는 scala tympani에 낸 구멍을 통하여 난원창으로 시켰으며 관류 후, 정원창을 제거하고 와우 immersion은 냉장고에 하루밤동안 시켰다. Glutaldehyde로 하루밤 고정시킨 후, 와우를 0.1M phosphate buffer로 scala tympani에 구멍을 통하여 씻어내었다. 이 과정을 3번한 후 1.5% OsO4로 후고정 하였다. 다음으로는 현미경하에서 와우의 bony capsule을 제거하였다. 채취된 조직을 2×50%, 70%, 85%, 95%, 3×100%로 탈수하고 Pebri로 건조후 13nm platinum으로 도포된 sputter에 놓은 후, 이 조직을 Hitachi S-500 scanning electron micoscope를 사용하여 관찰하고 Polaroid type 55 land film으로 촬영하였다.
통계 처리
정상대조군과 PAF군의 비교를 위해 paired T-test로 통계처리를 하였고, 이때 유의 수준은 <0.05로 하였다.
결과
뇌간유발반응 청력검사
정상대조군의 청력역치는 실험전은 13.3 dB이었으며 PBS 유치 2시간후 16.7 dB로 증가하였고 이후 8시간까지 18 dB에서 20 dB사이로 나타났다. PAF군에서는 PAF를 정원창에 유치시킨 후 2시간부터 8시간까지 청력역치가 29.7 dB에서 49.7 dB로 점차 유의하게 높아지는 경향을 보였다(Table 1). 정상대조군에 대한 PAF군의 청력역치의 변화는 각 시간마다 통계적으로 의미있는 차이(p<0.05)를 보였다(Fig. 1).
주사전자현미경 소견
정상대조군의 와우에서는 내유모세포와 외유모세포 모두 잘 유지된 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 2). PAF군은 내유모세포, 외유모세포 모두 손상을 받은 것을 관찰할 수 있었다. 외유모세모의 경우 가장 외측 열의 세포가 손상을 가장 많이 받았다. 와우 전장에 걸쳐 stereocilia의 파괴, 휘어짐, 손실 등이 관찰되었다(Fig. 3). Fig. 2와 Fig. 3은 와우의 mid-turn에서 촬영하였다.
고찰
Platelet-activating factor (PAF)는 생화학적으로 1-O-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine이라는 화학명칭을 가진 활성화된 인지질이며, 호르몬, cytokines, inter-leukins과 같은 방법으로 세포간의 매개역할을 한다.4) 보통 인체에서는 혈관내피세포, 다형핵구, 호산구, 단핵구, 혈소판, 대식구, 비만세포와 정자아세포등에서 분비된다.4)5)
PAF는 광범위한 조직손상, 혈관외피세포, 내피세포의 비정상적 기능변화, 염증질환 및 과민성 반응을 나타낸 조직에서 상당량 검출된다.6) PAF의 기능도 각각의 조직이나 기관에 따라 다양하다. 또한 종(species)에 따라 그 기능이 다양하며, 일부 기능은 다른 매개물질의 영향을 받는다.
이러한 PAF의 과다생산과 축적은 병적인 상황에서 발생하여 조직손상을 유발한다.7)8) 일반적으로 PAF는 혈관투과도의 증가,9) 기관지 수축,10) 저혈압,10) chemotaxis,11) endotoxemia, septic shock12)등을 일으키는 것으로 알려져 있다. PAF의 중요한 생리적 기능은 혈관투과성과 혈관근조직에 작용하여 혈관의 구조와 혈류량을 조절하는 것이다.13) 또한 PAF는 세포를 자극하여 arachidonic acid를 분비시켜 eicosanoid로 대사 시키며14) 호산구 접착, 탈과립, leukotriene의 분비, 세포독성을 일으킨다.15) 또한 단핵구의 chemotaxis, superoxide의 분비, IL-1, TNF, IL-4와 같은 염증매개물질의 분비등을 자극한다.16) 그리고 중성구의 chemotaxis, 탈과립등을 자극한다. 인체의 중성구 경우, 외인성의 PAF는 PAF의 추가적인 생산을 유도하며17) phospholipase A2의 활성화를 요한다.
중이강내 저류액에서 PAF의 농도는 high performance liquid chromatography로 측정한 결과 장액성인 경우 32 μg/ml, 점액성인 경우 8 μg/ml, 화농성인 경우 6 μg/ml로 보고되고 있으며,18) 본 실험에서는 이보다 적은 농도인 1 μg/ml의 PAF를 사용하였다. 이렇게 적은 농도의 PAF로 청력의 변화가 일어나는 것과는 달리 실제 중이염이 있는 사람에게서는, 일반적으로 알려진 사실 즉 정원창막의 비후, 정원창소와에 과립성 조직의 존재등으로 염증매개물질이 잘 투과되지 못한다고 알려져있으나 이에 대한 연구는 좀더 필요할 것으로 생각된다.
이러한 PAF로 인해, 혈관투과성의 증가로 분비성 중이염1)2)과 구씨관 기능이상19)이 유발되고 정원창을 통한 투과로 청력소실을 가져오게 된다는 연구결과들이 있다.20)
저자들의 본 연구에서는 정상적인 정원창에 PAF를 유치시켜 와우의 유모세포의 손상과 뇌간유발반응 청력검사상 청력역치의 상승을 유발하였다. 이로써 다른 연구20)에서와 같이 PAF가 중이강에서 내이로 투과되어 청력역치의 변화를 가져온 것으로 생각된다. 정원창을 통하여 PAF를 투과시키는 것은 혈관내 주사를 통하여 넣는 것에 비하여 전신적인 독성효과를 피할 수 있고, 와우에 직접 전달되며, 전신작용에 의해 나타나는 결과와 혼동을 피할 수 있고, 정상적인 와우에 비침습적이고 자연스럽게 실험을 할 수 있다는 장점을 가지고 있다.
본 연구에서는 gelfoam에 PBS를 적시어 정원창에 놓은 정상대조군에서도 뇌간유발반응 청력검사상 다소의 청력역치 상승을 보였다. 이는 gelfoam이 고막 바로 내측에 위치하고, 정원창으로의 접근을 위해 bulla에 구멍을 낸 것 때문에 생긴 것으로 생각된다. PAF군에서 나타난 뇌간유발반응 청력검사상 청력역치의 상승은 PAF가 정원창을 투과하여 내이의 외림프액으로 유입되어서 비롯된 것으로 생각되며 이로 인하여 와우의 유모세포에 다양한 양상으로 손상을 일으킨 것으로 생각된다. 이는 외림프액내의 과도한 PAF의 생산 또는 유입이 와우유모세포의 손상을 가져오리라는 추론을 가능하게 한다. 이러한 추론은 PAF가 조직손상에 관여한다는 것은 많은 연구3)7)8)15)와 와우의 혈관수축, 혈류량 감소등의 허혈성 손상의 경우에도 와우내 PAF의 농도가 증가하여 와우유모세포에 손상을 주었으리라는21) 연구를 통하여 가능하다.
따라서 본 연구는 분비성 중이염에서 저류액내의 PAF가 정원창을 통하여 외림프액에 유입되어 와우유모세포의 손상과 청력감소를 가져올 수 있다는 사실을 제시한다.
결론
PAF를 기니픽의 정원창에 유치한 결과, 와우 유모세포에 다양한 정도의 손상을 보이고 8시간동안 청성뇌간유발반응검사상 청력역치가 중등도로 상승하였다. 이러한 결과로 볼 때 염증매개물질인 PAF가 각종 염증성 질환에서 감각신경성 난청을 일으키는 인자들중에 하나라고 생각된다. 추후 중이내 염증성 질환들에 있어서 조직이나 저류액내의 PAF에 대한 연구가 광범위하게 있어야 할 것으로 생각된다.
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