| Expression of Nitric Oxide Synthase in the Olfactory Bulb of the Rat during Development. |
| Yong Jin Park, Mun Yong Lee, He Ro Yoon, Il Song Joung, Soon Lim Shin, Myung Hoon Chun |
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea.
2Department of Anatomy, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea. |
| 흰쥐 후구에서 발생시기에 따른 산화질소 합성효소의 분포양상 |
| 박용진1 · 이문용2 · 윤희로1 · 정일성1 · 신순림2 · 천명훈2 |
| 가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실1;해부학교실2; |
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| 주제어:
후구ㆍ발생ㆍ산화질소합성효소ㆍ면역조직화학법. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
The presence and distribution of NADPH-diaphorase activity in the olfactory bulb during development has been reported. But the precise localization of NO-synthase (NOS) in the olfactory bulb during the developmental stages has not been studied yet. Therefore, we investigated the localization of NOS-immunoreactivity in a developing rat olfactory bulb by immunohistochemistry.
MATERIALS AND METHODS:
A total of 32 male and female Sprague-Dawley rats. They were of several prenatal and postnatal stages, such as the following: embryonic day 16 (E16), E18, E20, postnatal day 1 (P1), P5, P7, P14 and adult. Indirect immunoperoxidase method using rabbit polyclonal anti-bNOS antibody was performed for detecting the NOS immunoreactivity.
RESULTS:
In the main olfactory bulb, the first NOS-immunoreactive (IR) neurons were observed in the presumptive granule cell layer (GCL) by E18, and in the glomerular layer (GL) by P1. The density of these neurons was increased as the development stage approached the adult stage. In the GCL, two types of NOS-immunoreactive neurons were observed: intensively stained large, short axon cells and weakly stained small, granule cells. The first, localized in the deeper part of the GCL, was observed in the earlier developmental stages, and the latter which increased in number to the adult period was observed by P1. In the accessory olfactory bulb, NOS-IR neurons were first detected in the GCL by P1, and increased in number to the adult period. The pattern of NOS-IR neurons in the GCL of the accessory olfactory bulb is similar to that in the main olfactory bulb.
CONCLUSION:
Our results demonstrated that bNOS had a characteristic temporal and spatial patterns of expression in the main and accessory olfactory bulb of the rat during development. |
| Keywords:
Olfactory bulbㆍDevelopmentㆍNO-synthaseㆍImmunohistochemistry |
서론
산화질소(nitric oxide)는 6초 정도의 매우 짧은 반감기를 가진 자유기(free radical) 가스로 혈관이완 작용과 종양 및 세균살상 작용을 매개하며, 특히 신경계통에서는 신경전달물질로 작용하여 기억, 감각전달 등의 다양한 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다.1)2) 산화질소를 합성하는 산화질소합성효소(nitric oxide synthase, NOS)는 신경세포형 산화질소 합성효소(bNOS), 내피세포형 산화질소 합성효소(eNOS)와 유발형 산화질소 합성효소(iNOS)의 3가지 형태로 존재하며, 이들 모두 L-arginine 의 말단 guanidine질소를 산화시켜 산화질소와 citrulline을 합성하고 이때 조효소로 NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)를 필요로 한다.2) 산화질소는 그 존재를 형태학적으로 밝히기가 매우 어려우므로 NADPH diaphorase(NADPH-d) 조직화학법을 이용한 연구나 NOS 항체를 이용한 면역조직화학법에 의하여 산화질소가 관여하는 신경지배의 존재를 간접적으로 밝힐 수 있다. 일반적으로 NADPH-d 염색과 NOS 면역염색은 서로 유사한 결과를 보이나, 모든 NADPH-d 활성이 NOS와 관련되는 것은 아닌 것으로 알려져 있다.3) 특히 후구(olfactory bulb)에서 후각신경과 사구체에 대한 NADPH-d 활성이 NOS와 관련되는지에 대해서는 서로 상반되는 연구결과가 발표되어 있다.4)5)
흰쥐 성체의 후구에서 행해진 NADPH-d 조직화학법과 NOS 면역염색에 의한 여러 연구 결과에서 이들 반응세포들은 광범위한 분포영역을 보여, 산화질소가 후각의 전달과정에서 중요한 역할을 하고 있음을 알 수 있다.6-8) 또한 최근 후구의 발생시기에 따른 NADPH-d 반응양성 신경세포에 대한 연구는 후구의 발생과정에서도 산화질소가 관여하고 있음을 시사하고 있다.9) 그러나, 발생시기에 따른 NOS 면역반응 신경원의 분포에 대해서는 밝혀져 있지 않았다. 그러므로 본 연구에서는 흰쥐 주후구(main olfactory bulb)와 부후구(accessory olfactory bulb)에서 산화질소의 역할에 대한 연구의 일환으로 bNOS항체를 이용한 면역조직화학법으로 흰쥐 후구의 발생시기에 따른 bNOS면역반응세포의 분포를 밝히고자 한다.
재료 및 방법
실험재료
건강한 체중 200 gm 내외의 Sprague-Dawley계 암쥐를 숫쥐와 함께 교배시킨 후 질전(vaginal plug)이 확인이 되면 이 때를 가임일(태생 1일)로 정하였다. 태생 16일, 18일, 20일, 생후 1일, 5일, 7일, 14일 및 성체 흰쥐까지 각 단계마다 4마리씩 총32마리를 사용하였다.
실험방법
조직처리 태생 16일, 18일과 20일군의 태아는 4% chloral hydrate(10 mg/Kg)로 마취한 임신 쥐를 제왕절개하여 얻었다. 생후 1일군의 흰쥐는 저체온법을 이용하여 마취하였으며 생후 5일, 7일, 14일군 및 성체 흰쥐는 4% chloral hydrate(10 mg/Kg)를 복강 내 주사하여 마취하였다. 태생 16일군의 태아는 두부만을 제거한 뒤 4% paraformaldehyde-0.2% picric acid 혼합액(0.1 M PB)에 고정하였다. 다른 단계의 실험동물들은 좌심실을 통하여 0.1 M phosphate buffer(PB, pH 7.4)와 4% paraformaldehyde-0.2% picric acid 혼합액(0.1 M PB)을 차례로 관류하였다. 두부(태생 16일군) 혹은 두개골이 제거된 다음 적출된 후구(다른 단계의 실험동물)를 같은 고정액에서 3시간 재고정하였다. 동결방지를 위해 30% sucrose용액(0.1 M PB)에 16시간 담근 후 냉동절편기를 사용하여 30 μm의 관상절편을 만들었다.
면역조직화학적 염색
부유법(free floating method)으로 간접면역 과산화효소법(indirect immunoperoxidase method)을 이용하여 면역염색을 시행하였다. 조직내의 비특이면역반응을 제거하기 위하여 10% normal donkey serum으로 1시간동안 처치하였다. 1차 항체는 rabbit anti-NOS antiserum(Sigma, MO, USA)을 1：10,000으로 희석하여 사용하였고 4℃에서 24시간 동안 처치하였다. 2차 항체로는 peroxidase가 표지된 donkey anti-rabbit IgG(희석비율 1：100, Jackson Immuno Research Lab. PA, USA)를 사용한 후, 0.05% 3,3'-diaminobenzidine-tetrahydroch-loride-0.01% H2O2혼합액으로 발색하였다. 면역염색이 끝난 후 여러 시기의 후구 관상절편에서 NOS 면역반응 세포의 발현시기와 양상을 비교 관찰하였다. 음성대조군은 일차항체 대신 normal donkey serum을 사용하여 위와 같은 방법으로 염색하였다.
결과
발생 중 여러 시기의 후구에서 bNOS 항체를 이용한 면역염색 결과, 발생 시기에 따라 다양한 bNOS 면역반응세포의 분포양상을 관찰하였다. 음성대조군에서 bNOS 양성세포는 관찰되지 않았다.
주후구의 층(layer)에 따른 bNOS 면역반응세포의 발현양상
태생 18일부터 후각신경층(olfactory nerve layer), 사구체층(glomerular layer), 외총상층(external plexiform layer), 승모세포층(mitral cell layer)과 내총상층(internal plexiform layer) 및 과립세포층(granule cell layer)의 5층으로 구분되었으며 이때부터 사구체층 내에서 사구체의 형태가 갖추어지기 시작했다.
후각신경층
태생 16일군부터 성체까지 후각신경층에서 bNOS 면역반응 세포는 관찰 되지 않았다(Figs. 1A, B, 2A and C).
사구체층
태생 16일군부터 성체까지 사구체에서는 bNOS 면역반응이 관찰되지 않았다(Figs. 1A, B, 2A and C). bNOS 면역반응세포는 생후 1일군의 사구체 주위에서 처음 관찰되었으며(Fig. 1B) 점차 그 수가 증 가하여 생후 7일군에서는 비교적 많이 관찰되었다(Fig. 2A). 생후 14일군과 성체에서는 7일군과 비슷한 양상이었으나 성체에 가까울수록 세포수가 증가되고 돌기가 잘 발달되어 있었다(Fig. 2C).
외총상층
태생 16일군부터 생후 5일군까지 bNOS 면역반응 세포가 관찰되지 않았으나 생후 7일군부터
성체까지는 드물게 관찰되었다(Fig. 2A).
승모세포층과 내총상층
태생 16일군부터 성체까지 bNOS 면역반응 세포가 관찰되지 않았다(Figs. 1A, B and 2A).
과립세포층
bNOS 면역반응을 나타내는 세포는 태생 18일군의 원시과립세포층(primordial granular cell layer)에서 처음 관찰되었다(Fig. 1A). 이들 세포는 주로 다극신경원(multipolar neuron)으로 조직절편 당 1∼2개로 드 물었다. 태생 20일군에서는 절편 당 3∼4개의 bNOS 면역반응세포가 관찰되어 그 수가 증가하였으나, 분포부위는 원시과립세포층에 국한되었다. 생후 1일군에서 bNOS 면역반응세포의 대부분은 과립세포층에 분포하였으며 사구체층에 위치하는 세포들에 비하여 세포체가 크고 강한 면역반응을 나타내었다(Fig. 1B). 생후 7일군에서는 비교적 많은 bNOS 면역반응세포가 과립세포층 전층에 걸쳐 분포하였는데 세포체의 크기와 면역염색의 정도에 따라 두 종류의 세포가 뚜렷이 구분되었다. 즉 세포체가 크고, 강한 면역반응을 보이는 세포는 주로 과립세포층의 안쪽에 위치하였으며, 비교적 세포체의 크기가 작고 면역반응이 약한 세포는 과립세포층의 바깥쪽에 위치하였다. 한편 과립세포층의 안쪽에 분포하는 세포들은 주로 다극신경원의 모습이었으나 드물게 이극신경원(bipolar neurons)의 모습을 보이는 신경원도 관찰되었다(Fig 2A). 생후 14일군에서는 7일군에서와 비슷한 양상이었으나 세포체의 크기가 작고 면역반응이 약한 세포의 수가 증가되어 면역반응세포의 대부분을 차지하였으며, 강한 면역반응을 보이는 큰 세포는 드물게 관찰되었다(Fig. 2B). 이와 같은 분포양상은 성체에서도 유사하게 관찰할 수 있었다(Fig. 2D).
부후구의 층에 따른 bNOS 면역반응세포의 발현양상
태생 20일부터 서골코신경층(vomeronasal nerve fiber layer), 사구체층, 승모세포층, 내총상층 및 과립세포층의 5층으로 구분되었다.
서골코신경층, 사구체층, 승모세포층 및 내총상층
태생 16일군부터 성체까지 bNOS 면역반응 세포가 관찰되지 않았다.
과립세포층
bNOS 면역반응을 나타내는 세포는 태생기에서는 관찰되지 않았으며 생후 1일군에서 처음 관찰되었는데 세포체가 크고 강한 면역반응을 나타내었다(Fig. 3A). 생후 7일군에서는 bNOS 면역반응세포의 수가 증가하였으며 이들 세포는 세포체가 작고 약한 면역반응을 보였다(Fig. 3B). 생후 14일군에서 bNOS 면역반응세포는 주후구에서와 유 사한 분포양상을 보여 세포체가 크고, 강한 면역반응을 보이는 세포는 과립세포층의 안쪽에 분포한 반면, 세포체의 크기가 작고 면역반응이 약한 세포는 과립세포층의 전층에 걸쳐 관찰되었다(Fig. 3C and D). 성체에서는 14일군에 비해 많은 bNOS 면역반응세포를 관찰할 수 있었으며, 이들 세포는 작고 면역반응이 약한 세포가 대부분이었다(Fig. 3E and F).
고찰
주후구의 발생과정에서 bNOS 면역반응세포는 발생시기에 따라 독특한 출현 양상을 나타내었다. bNOS 면역반응세포는 출생 이전에는 원시과립세포층에서만 관찰되었으며, 사구체층과 총상층의 면역반응세포는 출생 이후부터 관찰되어 부위에 따라 bNOS 면역반응세포의 발생시기가 다름을 알 수 있었다. 이와 같은 실험결과는 NADPH-d 조직염색의 결과9)와 대체로 유사하였으나, 이들 세포의 출현시기와 분포부위에서 다소 달랐다. NADPH-d 활성을 보이는 세포들은 출생 직전인 태생 21일에 원시사구체층과 과립세포층에서 처음 염색됨이 보고된 반면, 본 실험에서 bN-OS 면역반응세포들은 태생 18일에 원시과립세포층에서만 관찰되었다. 이러한 차이는 NOS 면역조직화학법이 신경세포형 산화질소 합성효소의 존재를 증명하는데 현재까지 광범위하게 사용된 NADPH-d 조직화학법 보다 특이도가 훨씬 높음을 제시하는 결과라 생각된다. 또한 후각상피로부터 나온 구심성 신경인 후각신경 및 후구의 사구체에서 bNOS 면역반응성을 관찰할 수 없었던 본 실험의 결과는 같은 부위에서 NADPH-d의 활성을 보고한 연구결과9)와 상반된 양상을 보였다. 이러한 연구결과는 흰쥐, 생쥐, 원숭이와 사람을 대상으로 한 연구결과5)10-12)에서도 동일하게 보고되고 있다. Alonso 등11)은 이러한 염색 차이의 원인으로 NOS와 분자생물학적 특징을 공유하는 것으로 알려져 있는 포유동물 효소13)14)인 cytochrome P450 reductase를 제시하였다. bNOS 면역반응세포들은 태생 18일군의 원시과립세포층에서 처음 관찰되었으며 이들 세포는 세포체의 크기가 큰 다극신경원으로 강한 면역반응을 나타내었다. 이러한 세포들은 출생 후 과립세포층에서 점차 숫적인 증가를 보였는데, 생후 7일부터 과립세포층의 안쪽에 분포하여 바깥쪽에 위치하는 세포체의 크기가 작고 약한 면역반응을 보이는 세포들과 뚜렷이 구분되었다. 세포체가 크고, 강한 면역성을 보이는 이들 세포는 세포체의 크기, 위치 및 돌기의 모습 등으로 단축삭세포(short axon cell)중 심층세포(deep cell)로 생각되며,15) 세포체의 크기가 작고 비교적 약한 면역성을 보이는 세포들은 과립세포로 생각된다. 후구에서 단축삭세포의 기능은 아직 밝혀져 있지 않으나, 성체에서 과립세포에 탈억제작용을 하는 것으로 추측되고 있다.16) 본 실험결과, 후구의 단축삭세포는 가장 먼저 bNOS 면역반응성을 보이며, 특히 태생기에 유일하게 bNOS 면역반응성을 보이는 사실로 미루어 bNOS 면역반응성 단축삭세포가 후구의 발생과정에서 중요한 기능을 할 것임을 추측할 수 있다. 또한 태생기에 발생하는 것으로 알려진 원심성 신경원인 승모세포(mitral cell)와 속모세포(tufted cell)17)에서는 bNOS 면역반응을 보이지 않는 반면, 대부분이 출생후에 발생하는 중간신경원인 사구체주위세포(periglomerular cell), 단축삭세포와 과립세포(granule cell)17)에서만 bNOS 면역양성반응을 보이는 것은 산화질소가 주후구내 중간신경원의 발생에 관여할 것임을 시사한다 하겠다.
부후구의 발생과정에서 bNOS 면역반응세포는 출생이전에는 전혀 관찰되지 않았으며, 출생 이후에도 과립세포층에만 국한되어 관찰되었다. 이러한 결과는 부후구내 bNOS 면역반응세포의 발생시기와 분포부위가 주후구에서와 차이가 있음을 시사하며, 부후구의 발생에서 NADPH-d 조직염색을 보고한 연구결과9)와 동일한 양상을 나타내었다.
대부분이 출생이후에 발생하는 것으로 알려져 있는 부후구내 사구체주위세포17)는 본실험에서 거의 bNOS 면역반응을 나타내지 않았는데, 이는 부후구내 사구체 주위세포에는 NO / cGMP 체제가 없다는 사실18)을 간접 설명하는 결과라 할 수 있다. 한편 부후구내 과립세포층의 bNOS 면역반응세포는 세포체가 크고 강한 면역반응을 보이는 단축삭세포와 작고 약한 반응을 보이는 과립세포로 구분되는데, 단축삭세포는 생후 1일군에서부터 관찰되는 반면, 과립세포는 생후 7일군에서부터 보였다. 따라서 부후구의 bNOS 면역반응세포의 발현시기가 주후구에 비하여 늦으나 발현양상은 유사함을 알 수 있었다. 그러나 이러한 연구결과는 부후구내 신경세포의 합성이 주후구에서 보다 선행된다는 연구보고17)와는 달랐으며, 이러한 차이는 부후구의 신경세포가 합성된 후 주후구에서 보다 비교적 늦게 bNOS 발현을 보이고 있음을 시사하고 있다. 부후구에서 관찰된 bNOS 면역반응성을 보이는 단축삭세포는 소수였으며, 대략 10% 내외의 세포만이 출생 후에 발생하는 과립세포17)가 출생 7일군에서부터 부분적으로 NOS 면역반응을 나타내는 것으로 보아 주후구에서와 달리 산화질소가 부후구의 발생과정에 중요한 역할을 하지 못할 것으로 생각된다.
결론
면역조직화학법을 이용하여 흰쥐 후구의 발생시기에 따른 bNOS 면역반응세포의 발현양상을 관찰한 결과, 주후구와 부후구에서 발생시기에 따라 독특한 출현 양상을 나타내었다. 주후구에서 bNOS 면역반응세포는 출생 이전에는 원시과립세포층에서만 관찰되었으나, 출생 이후 사구체층과 총상층에서도 관찰되었다. 그러나 부후구의 발생과정에서 bNOS 면역반응세포는 출생 이전에는 전혀 관찰되지 않았으며, 출생 이후에도 과립세포층에 국한하여 관찰되었다.
REFERENCES
1) Bredt DS, Snyder SH. Nitric oxide, a novel neuron messenger. Neuron 1992;8:3-11.
2) Zhang J, Snyder SH. Nitric oxide in the nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1995;35:213-33.
3) Matsumoto T, Nakane M, Pollock JS, Kuk JE, Forstermann U. A correlation between soluble brain nitric oxide synthase and NADPH-diaphorase activity is only seen after exposure of the tissue to fixative. Neurosci Lett 1993;155:61-4.
4) Dellacorte C, Kalinoski DL, Huque T, Wysocki L, Restrepo D. NADPH diaphorase staining suggests localization of nitric oxide synthase within mature vertebrate olfactory neurons. Neuroscience 1995;66:215-25.
5) Kishimoto J, Keverne EB, Hardwick J, Emson PC. Localization of nitric oxide synthase in the mouse olfactory and vomeronasal system: A histochemical, immunological and in situ hybridization study. Eur J Neurosci 1993;5:1684-94.
6) Vincent SR, Kimura H. Histochemical mapping of nitric oxide synthase in the rat brain. Neuroscience 1992;46:755-84.
7) Lee HM, Kim ST, Park JS, Lee SH, Hwang SJ. Immunohistochemical study on the distribution of nitric oxide synthase in rat's olfactory system. Korean J Otolaryngol 1996;39:1694-99.
8) Davis BJ. NADPH-diaphorase activity in the olfactory system of the hamster and rat. J Comp Neurol 1991;314:493-511.
9) Samama B, Boehm N. Ontogenesis of NADPH-diaphorase activity in the olfactory bulb of the rat. Dev Brain Res 1996;96:192-203.
10) Spessert R, Wohlgemuth C, Reuss S, Layes E. NADPH-diaphorase activity of nitric oxide synthase in the olfactory bulb: Co-factor specificity and characterization regarding the interrelation to NO formation. J Histochem Cytochem 1994;42:569-75.
11) Alonso JR, Porteros A, Crespo C, Arevalo R, Brinon JG, Weruaga E, et al. Chemical anatomy of the macaque monkey olfactory bulb: NADPH-diaphorase / nitric oxide synthase activity. J Comp Neurol 1998;402:419-34.
12) Kulkarni AP, Getchell TV, Getchell ML. Neuronal nitric oxide synthase is localized in extrinsic nerves regulating perireceptor processes in the chemos-ensory nasal mucosae of rats and humans. J Comp Neurol 1994;345:125-38.
13) Bredt DS, Hwang PM, Glatt CE, Lowenstein C, Reed RR, Snyder SH. Cloned and expressed nitric oxide synthase structurally resembles cytochrome P-450 reductase. Nature 1991;351:714-8.
14) Lowenstein CJ, Snyder SH. Nitric oxide, a novel biologic messenger. Cell 1992;70:705-7.
15) Scott JW, McDonald JK, Pemberton JL. Short axon cells of the rat olfactory bulb display NADPH-diaphorase activity, neuropeptide Y-like immunore-activity and somatostatin-like immunoreactivity. J Comp Neurol 1987;260:378-91.
16) Gall C, Seroogy KB, Brecha N. Distribution of VIP-and NPY-like immuno-reactivities in rat main olfactory bulb. Brain Res 1986;374:389-94.
17) Bayer SA. 3H-thymidine-radiographic studies of neurogenesis in the rat olfactory bulb. Exp Brain Res 1983;50:329-40.
18) Breer H, Shepherd GM. Implication of the NO / cGMP system for olfaction. Trends Neurosci 1993;16:5-9.
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