서     론

   산화질소(NO)는 반감기가 짧은 반응성 질소물로서 여러 세포에서 산화질 소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)에 의해서 생산되며 혈관의 이완, 신경 전달, 혈액응고, 염증반응 및 종양세포나 기생생물에 대한 숙주면역계의 방어기능등 여러 가지 생리적 기능을 나타내고 고농도로 존재할 때 세포독성을 나타낸다.¹⁾²⁾
   대식세포는 세포의 손상과 염증반응에서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는데, 특히 대식세포가 내독소나 tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β) 및 interferon-γ(IFN-γ) 등의 자극에 의해 활성화되면 superoxide와 과산화수소(H₂O₂) 등과 같은 반응성 산소대사물들(reactive oxygen species)을 분비하게 되는데, 이들에 의해서 대식세포 활성화가 진행되고 미생물 살균효과와 세포용해기능 등을 나타낸다.³⁾ 또한 자극된 대식세포는 유발형 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)유전자의 발현을 통하여 고농도의 산화질소와 그 산화물인 nitrite(NO₂^-)와 nitrate(NO₃^-)를 생성함으로써, 염증반응을 증가시키고 세포와 조직 손상을 초래한다.⁴⁾ 이러한 산화질소는 최근 쥐에서 내독소로 유도된 실험적 삼출성 중이염의 중요한 매개물질로 외부자극에 대한 기도 과민반응 및 기도염증 등에 관여하는 것으로 알려져 있으며⁵⁾⁶⁾ NOS중에서도 iNOS가 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.⁵⁾

   반응성 산소대사물인 과산화수소(H₂O₂)는 상대적으로 비반응성의 산소류 로서 철이온(Fe²⁺)이나 구리이온(Cu²⁺)이 존재할 때 세포 내로 수동적으로 들 어가 반응성이 큰 hydroxyl radical로 전환되거나 항산화제인 catalase에 의해 물(H₂O)과 산소(O₂)로 전환된다.⁷⁾ 반응성 산소대사물은 세포손상의 병태 생리기전에 중요한 역할을 하고⁸⁾ 기도염증에서 혈장 삼출 및 상피세포의 탈락에 관여하는 것으로 알려져 있다.⁹⁾
   Glucocorticoid는 염증 및 면역반응에 대한 강력한 조절작용과 대식세포에 의한 세포독성을 억제하고 내독소와 cytokine에 의한 대식세포의 산화질소 생성을 억제하는 것으로 알려져 있다.¹⁰⁾
   저자들은 염증환경 내에서 생성되는 대표적 산화물인 H₂O₂가 내독소로 자극된 대식세포에서 iNOS 발현과 산화질소의 생성을 증가시키는지 알아보고 H₂O₂가 iNOS 발현과 산화질소 생성을 증가시킨다면 항산화제인 catalase와 thiol 항산화제인 2-mercaptoethanol이 iNOS 발현과 산화질소 생성을 억제시킬 수 있는지 알아보았다. 또한 glucocorticoid가 내독소와 H₂O₂에 의한 산화 질소 생성도 억제할 수 있는지 그리고 어느 단계에서 이러한 효과를 나타내는지 알아보았다.

재료 및 방법

마우스 대식세포주 RAW264.7의 배양 및 자극

   마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포(ATCC, Rockville, MD)를L-glutamine(2 mM), penicillin(100 U/ml)-streptomycin(100 μg/ml ; Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5% heat-inactivated fetal bovine serum(Gibco)등을 포함한 RPMI 1640(Gibco, Grand Island, NY, USA)배지의 플라스크에 넣어 37°C, 95% air, 5% CO₂ 배양기에서 증식 배양한 후 1×10⁷개로 각각 분주하였다. 대조군은 자극없이 3 ml의 RPMI 만 주었고, 자극군은 24 시간 동안 1 μg/ml E. coli Lipopolysacchride(LPS, serotype 055 ; Sigma)와 2mM H₂O₂로 자극하였다. 각각의 자극군에 대해 항산화제 실험에서는 3000 U/ml catalase, 20 mM 2-mercaptoethanol를 추가하여 추가하지 않은 군과 비교하였고 mercaptoethanol은 3시간 전처치한 후 LPS와 H₂O₂로 자극하였다. Dexamethasone(DEX) 실험에서는 5 μM DEX를 추가하여 비교하였고 산화질소 생성의 시간별 효과를 알아보기 위해 DEX을 동시에, 3시간, 6시간, 12시간 후에 각각 추가하였으며 DEX의 효과와 비교하기 위해 비특이적 NOS 억제제인 2 mM L-NAME(NG-nitro-L-arginine methyl ester)을 같은 방법으로 추가하였다.

산화질소 산화물(Nitrite와 Nitrate)의 측정

Nitrite의 측정
   24시간 동안 자극된 각각의 RAW264.7 세포주의 상층액을 각각 400 μl씩 분주하고 대조군으로 RPMI 1640을 400 μl씩 분주한 후 Griess reagent을 이용 하여 Diazo chromophobe가 생기는 것을 spectrophotometer(UV-240, Graphicord, Shimadzu, Japan)로 530, 540, 550 ㎚에서 absorbance를 측정하였다. Griess reagent로는 먼저 0.2 N HCl 25 ml에 2% sulfanil amide(Sigma) 0.5 g을 녹인 용액을 각각 200 μl씩 넣고, 증류수 25 ml에 0.8% N-(1-Naphthyl)-ethylene-diamine(Sigma) 0.2 g을 녹인 용액을 각각 200 μl씩 넣은 후 10분 간 방치하였다. Standard curve는 sodium nitrite(Sigma)를 0.1 μM 농도부터 1000 μM 농도까지 측정하여 linear regression analysis를 이용하여 만든 후 각 검사물의 absorbance와 비교하여 그 양을 정량하였다.

Nitrite+nitrate의 측정
   Nitrate는 Aspergillus에서 얻은 0.1 U/ml의 nitrate reductase(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 이용하여 nitrite로 환원시킨 뒤 Griess reaction을 이용하여 측정하였다. Nitrate reductase의 조효소로 50 μM NADPH(Calbiochem, Darmstadt, Germany)를 이용하여 2시간 동안 반응시켰으며 nitrite+nitrate의 양은 μM/10⁷cells로 표시했고 통계학적 처리는 Student's t-test로 하였다.

iNOS cDNA 탐식자(probe) 제작
   iNOS mRNA의 검출을 위하여 741 bp의 iNOS cDNA probe(Genbank accession # U43428, 5' primer: CACAAGG CCACATCGGATTTC；3' primer：TGCATACCACTTCAACCCGAG)를 마우스 대식세포 RNA로부터 RT-PCR을 이용하여 만들었다. 즉 RAW264.7 세포로부터 분리된 RNA를 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Boehringer Mannheim, Germany)을 이용 하여 역전사반응을 시켰다. 역전사반응은 1 μg RNA sample에 100 mM Tris와 500 mM KCL; pH 8.3을 포함한 10×reaction buffer 2.0 μl, 25 mM MgCl₂ 4.0 μl, dNTP(10 mM) mix 2.0 μl, RNase inhibitor 1.0 μl(50 unit), AMV(avian myoblastosis virus) 역전사효소 0.8 μl 그리고 Oligop(dT)₁₅ primer 2.0 μl, gelatin 0.4 μl 등을 섞어서 vortex하고 원심분리한 후 25°C에서 10분간 반응시키고 이어서 42°C 60분, 99°C 5분, 4°C 5분 반응시킨 후 -20°C에 보관하였다. 이렇게 얻은 cDNA를 PCR DIG Probe Synthesis Kit (Boehringer Mannheim, Germany)를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction:PCR)에 사용하였다. 즉 PCR은 MgCl2를 포함한 10x PCR buffer 2 μl, dNTP mixture(200 μM) 4 μl, DIG-(11)-dUTP(70 μM ) 1.4 μl, 5' primer(20 μM) 2 μl, 3' primer(20 μM) 2 μl, Template DNA 1 μg, Taq polymerase(0.5 U) 1 μl, sterile water 5.6 μl 등을 넣고 light mineral oil(Sigma)을 한 방울 넣은 후 Thermal Cycler(Perkins Elmer Corp, USA)를 이용하여 시행하였다. Thermal cycler는 94°C에서 1분간 predenature시키고, denaturation은 94°C에서 45초, annealing은 55°C에서 45초, elongation은 72°C에서 60초로 조정하였고 총 35 cycle을 시행한 후 10 μl를 1.0% 한천젤에 전기영동한 후 ethidium bromide(Sigma)로 염색하여 단일띠 를 확인하고 제작물 크기를 확인하였다(Fig. 1). 음성대조군으로 cDNA 대신 증류수를 사용하였고 RT-PCR 산물은 PCR fragment의 sequencing(dsDNA Cycle Sequencing System, GIBCO BRL)에 의해 확인하였다.

iNOS mRNA의 발현을 위한 Northern-blot

   각기 자극된 세포군의 RNA를 RNAzol^TM B RNA Isolation System(Tel-Test, USA)을 이용하여 분리한 후 동량의 RNA(5 μl)에 15 μl의 RNA loading buffer를 넣고 끓는 물에 5분간 가열한 후 급히 얼음 위에 방치하고 2.2 M formaldehyde(Sigma)를 함유한 1.0% 한천젤에 loading한 후 5 volts /cm로 1~2시간 정도 전기영동하여 bromophenol blue dye가 젤판의 3/4정도 이동하게 하였다. 젤 판을 이등분하여 일부는 ethidium bromide로 염색하여 자외선 조사하에 18S, 28S rRNA band를 확인하였다. 다른 겔판은 10× SSC (1.5 M NaCl, 0.15 M Na-citrate)에 10분 동안 3번 세척하여 formaldehyde 를 제거한 후 모세관 전이법을 이용하여 nylon 막(Nylon membranes, posi tively charged, Boehringer Mannheim)에 밤새도록 이동시켰다. 그 후 nylon 막을 2×SSC에 5분동안 세척하고 3M paper에서 건조시킨 후 UV Crosslinker (FB-UVXL-1000, Fisher Biotech. USA)로 교차결합(crosslink)시켰다. 이를 5 ml의 전교잡 용액(prehybridization solution；50% formamide, 5×SSC , 2% blocking reagent, 0.1% N-lauroylsarcosine, 50 mM sodium phosphate , 7% SDS)으로 50°C에서 1시간 동안 Hybridization incubator(HI-16000 , Tyler, Canada)를 이용하여 prehybridization시키고 나서 전교잡 용액을 버린 뒤 열로 변성시킨 DIG(digoxigenin)-labeled iNOS probe를 넣어 50°C에서 밤새도록 반응시켰다. 실온에서 washing solution(solution I : 1×SSC/0.1% SDS 10분, solution II : 0.1×SSC/0.1% SDS 15분)으로 수세 하고 alkaline phosphatase-conjugated anti-DIG Fab fragment (1:10,000)로 30분간 반응시키고 chemiluminescene substrate 용액에 15분간 반응시킨 후 화학발광신호를 X-선 필름(Fuji, HR, Japan)에 감광시켰다. 각 lane간의 오차를 줄이기 위하여 β-actin probe를 교잡시킨 후 자가방사기록을 해서 각각의 iNOS band와 비교하였다. 각각의 세포군에서 iNOS mRNA levels을 비교하기 위해 scanning laser densitometry(Pharmacia Biotech, USA)을 이용하여 iNOS/β-actin mRNA비로 측정하였다.

결     과

내독소로 유발된 산화질소 형성에 대한 DEX 및 L-NAME의 시간별

   효과 RPMI만 준 대조군에서 NO₂^-+NO₃^-의 양은 2.2±0.6 μM/10⁷cells 이었고 LPS로 자극한 군은 44.2±5.9 μM/10⁷cells로 유의하게 증가하였다. LPS로 자극하고 DEX를 동시에, 3시간 후에 추가로 주었을 때 NO₂^-+NO₃^-의 양은 17.1±4.3, 33.6±5.1 μM/10⁷cells로 LPS만 준 군보다 유의하게 감소하였 고 L-NAME를 동시에, 3시간, 6시간 후에 추가로 주었을 때 NO₂^-+NO₃^-의 양은 19.2±3.4, 18.4± 4.3, 25.2±4.1 μM/10⁷cells로 LPS만 준 군보다 유의하게 감소하였다(p<0.05)(Fig. 2).

H₂O₂의 자극농도에 따른 산화질소 형성
LPS로 자극하고 추가로 자극하는 H₂O₂의 농도를 250 μM, 500 μM, 1 mM, 2 mM로 증가시켰을 때 NO₂^-+NO₃^-의 양은 각각 52.1±4, 67.5±5.3, 75.4±4.7, 82.3±9.2로 자극농도에 비례하여 NO₂^-+NO₃^-의 양이 유의하 게 증가하였다(p<0.05)(Fig. 3).

내독소와 H₂O₂로 유발된 산화질소 형성에 대한 DEX의 효과
   H₂O₂로만 자극한 군의 NO₂^-+NO₃^-의 양은 15±4.3 μM /107cells 이었고 DEX를 추가한 경우에는 6.1±3.5 μM/107cells로 유의하게 감소하였다. LPS 와 2mM H₂O₂로 자극한 경우에 NO₂^-+NO₃^-의 양은 82.3±9.2 μM/107 cell 이었고 DEX를 동시에 추가한 경우에는 39.5±7.5 μM/107cell로 LPS와 H₂O₂의 자극에 의한 산화질소 형성을 유의하게 감소시켰다(p<0.05)(Fig. 4).

내독소와 H₂O₂로 유발된 산화질소 형성에 대한 항산화제의 효과
   H₂O₂로만 자극한 군에 catalase와 2-mercaptoethanol을 추가한 경우에 NO₂^-+NO₃^-의 양은 각각 5.2±2.3, 4.9±1.5 μM/10⁷cell로 H₂O₂에 의한 산화질소 형성을 유의하게 감소시켰고 LPS로 자극한 군에 catalase와 2-mercaptoethanol를 추가한 경우에는 40.1±6.5, 41.2±5.5 μM/107cell로 항산화제를 추가하지 않은 군과 차이를 나타내지 않았다. LPS와 H₂O₂로 자극하고 catalase와 2-mercaptoethanol를 추가한 경우에 NO₂^-+NO₃^-의 양은 45.9±7.5, 39.8±6.2 μM/107cell로 LPS와 H₂O₂의 자극에 의한 산화질소 형성을 유의하게 감소시켰다(p<0.05)(Fig. 5).

iNOS mRNA 발현에 대한 DEX와 항산화제의 효과
   Northern 분석으로 iNOS mRNA의 발현을 보았을 때 아무런 자극도 가하지 않은 경우에 iNOS mRNA는 거의 보이지 않았으나, LPS로 자극한 경우에 iNOS/β-actin mRNA 비는 0.05±0.01 이었고, LPS에 2mM H₂O₂를 추가한 경우에는 0.62±0.07로 뚜렷한 증가를 나타내었다. LPS와 H₂O₂로 자극한 군에 DEX를 추가한 경우와 2-mercaptoethanol을 추가한 경우는 각각 0.17±0.03, 0.16±0.04로 LPS와 H₂O₂에 의한 iNOS mRNA 발현을 유의하게 감소시켰다(p<0.05)(Fig. 6).

고     찰

   산화질소는 작고 비교적 불안정하며 독성이 있는 free radical 중의 하나로서 특이한 운반체나 채널을 통한 생체 내신호전달물질과는 다른 특성을 가지고 있으며 전기적 중성으로 합성된 곳에서 곧바로 확산되어 사방으로 퍼져서 작용하는데 이는 산화질소 작용의 조절이 합성에 의존하며, 분자적인 구조보다는 화학적 특성에 의해 결정됨을 의미한다.²⁾¹¹⁾
   대식세포가 활성화되면 산화질소합성이 증가하고 그 산화물인 nitrite와 nitrate도 증가되며, 반응성 산소대사물인 superoxide와 산화질소가 반응하여 peroxynitrite(ONOO-)를 형성하는데 이것들이 단백질의 tyrosine기를 질소화(nitration)시키고 sulfahydryl기를 산화시키며 세포막지질을 과산화시켜서 세 포손상에 결정적일 역할을 한다고 알려져 있다.¹¹⁾¹²⁾ 저농도의 산화질소에서는 대부분의 superoxide가 SOD(speroxide dismutase)와 반응하지만 iNOS의 발현에 의해 산화질소가 고농도로 존재하면 superoxide는 산화질소와 반응하여 강력한 산화제인 peroxynitrite를 형성하게 된다.¹¹⁾ 산화질소의 또 다른 세포독성기전은 aconitase, complex I 과 complex II 및 ribonucleotide reductase와 complex를 이루어 이러한 효소를 불활성화시키며 특정 단백질을 ribosylation시키는 것이다.¹¹⁾¹²⁾
   NOS는 여러 세포에서 다양한 자극에 반응하여 산화질소를 생성하는데 각각의 세포에서 자극되는 시간과 신호전달체계 및 산화질소의 생성양상이 다르다. 예로 신경세포와 혈관내피세포는 Ca²⁺에 의존적인 cNOS(constitutive NOS)를 표현하여 자극에 대해 즉시 소량의 산화질소를 생성한다. 반면에 대식세포, 설치류의 EMT-6 선암세포, 연골세포, 평활근세포, 간세포 및 활성화된 호중구등에서는 여러 가지 cytokine과 내독소의 자극에 대해 iNOS 를 발현해서 4~18시간의 지연기를 거쳐 많은 양의 산화질소를 생성하고¹³⁾ iNOS에 의한 산화질소 합성의 조절은 iNOS 유전자의 발현조절에 의존하므로 iNOS 유전자의 발현에 영향을 주는 cytokine이나 화학물질에 대한 연구는 중요하다고 볼 수 있다.⁴⁾¹¹⁾

   최근에 산화질소와 그 산화물들 및 반응성 산소대사물들이 여러 가지 염증성 조직 손상 시에 그 손상 반응의 매개물로서 중요성이 커지고 있는데 실험적으로 관절염, 만성 소화기 염증질환, 면역 복합체로 인한 폐 손상의 모델 및 중이염에 항산화제와 산화질소 합성효소 억제제 등을 투여하여 염 증과 조직손상을 줄일 수 있다고 보고하였다.⁵⁾¹⁴⁾ 중이염에서 산화질소는 고 농도로 존재하여 세포독성을 나타내고 세포 내 cyclic guanosine monophosphate(cGMP)의 증가를 통한 혈관내피세포의 혈관외 유출,    호중구 이동 및 기도 상피세포의 점액분비를 자극함으로써 중이염을 매개하는 것으로 생각 되고 있다.⁵⁾
   RAW264.7 세포주를 내독소로 자극했을 때 대조군에 비하여 nitrite와 nitrate의 양은 유의하게 증가하였고 iNOS mRNA 발현을 확인할 수 있었다.
   DEX는 내독소만 준 경우와 내독소와 H₂O₂를 준 경우 모두에서 유의하게 산화질소 생성을 억제하였고 DEX를 동시에, 3시간 후에 주었을 때만 
nitrite와 nitrate양이 의의 있게 감소하였다. 이것은 자극된 대식세포에서 iNOS mRNA가 2시간부터 만들어져 4~8시간에 최대치에 도달하는데¹⁵⁾ DEX가 이러한 mRNA의 발현억제를 통해 산화질소 생성을 억제하는 것을 시사하며 저자의 실험에서 Northern blot으로 DEX가 내독소 및 내독소와 H₂O₂에 의한 iNOS mRNA 발현을 억제하는 것을 관찰할 수 있었다. Glucocorticoid는 세포막을 통과해 세포질 내에 있는 수용체와 결합함으로써 활성화되고 이러 한 결합체가 핵 내로 들어가 염증과 관계된 유전자와 결합하여 유전자의 발 현을 조절하고 염증과 관계된 유전자 발현을 유도하는 activator protein-1(AP-1) 전사인자나 nuclear factor-κB(NF-κB) 전사인자와 결합하여 AP-1과 NF-κB의 작용을 억제한다.¹⁶⁾ NF-κB는 iNOS 유전자 발현의 가장 중 요한 전사인자이며¹⁷⁾ glucocorticoid는 이러한 NF-κB의 작용을 억제함으로써 iNOS 유전자의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다.¹⁶⁾ 비특이적 NOS 억제제인 L-NAME를 동시에, 3시간, 6시간 후에 주었을 때 nitrite와 nitrate 양이 의의있게 감소하고 12시간 후에 주었을 때 감소되지 않은 것은 iNOS가 발현되어 이미 상당한 양의 산화질소를 만들고 난 후 주었기 때문인 것으로 생각된다.

   내독소와 H₂O₂로 자극했을 때 nitrite와 nitrate 양은 내독소 만으로 자극 했을 때보다 유의하게 증가하였으며, 이때 H₂O₂ 자극농도에 비례하여 nitrite와 nitrate의 양도 증가하였다. 그리고 Northern blot에서도 H₂O₂의 자극이 추가됨으로써 내독소에 의한 iNOS mRNA발현이 증가되었다. 이러한 효과는 H₂O₂와 같은 산화제들이 NF-κB를 활성화시키는 것으로 알려져 있으므로¹⁸⁾ H₂O₂가 iNOS 유전자의 전사인자인 NF-κB를 활성화시켜 iNOS mRNA발현을 증가시키는 것으로 생각된다.
   Rubanyi¹⁹⁾는 superoxide와 H₂O₂에 의해서 관상동맥에 산화질소 생성이 증가하고 따라서 관상동맥 확장이 일어나는 현상이 catalase에 의해서 억제된다고 최초로 보고하였다. Catalase는 항산화제로서 본 연구에서 내독소와 H₂O₂와 catalase를 같이 넣고 세포를 자극했을 때 내독소로 유발되는 산화질소 생성에 대한 H₂O₂의 증폭효과를 catalase가 유의하게 억제시켰다. 또한 thiol scavenger인 mercaptoethanol을 사용하여 세포에 전처치하고 내독소와 H₂O₂로 자극했을 때 내독소로 유발된 산화질소 생성에 대한 H₂O₂의 증폭효과를 억제하였다. 생체 내에서 H₂O₂는 대부분 superoxide와 SOD의 반응 부산물로서 생기며, superoxide가 많이 발생하면 H₂O₂도 증가하게 된다. H₂O₂자체는 반응성이 약한 산화제이지만 세포막을 수동적으로 쉽게 투과해 들어가 iron-catalyzed Fenton 반응을 거쳐서 반응성이 큰 hydroxyl radical ( · OH)로 대사되는데⁷⁾ mercaptoethanol이 이 과정을 억제함으로써 효과를 나타내었다고 생각된다.²⁰⁾ 즉, H₂O₂를 세포 밖에서 자극했을 때 내독소로 유발된 산화질소 형성을 증폭시키는 것은 세포 밖의 H₂O₂자체에 의한 것이 아니고 세포내의 산화제, 아마도 Fenton 반응을 거친 hydroxyl radical이 이 러한 효과를 매개했을 가능성도 있다.⁷⁾
   결론적으로 본 연구에서 H₂O₂는 내독소의 iNOS mRNA의 발현유도와 산화질소 생성을 증폭시키며, 항산화제인 catalase와 mercaptoethanol은 내독소로 유발되는 산화질소 생성에 대한 H₂O₂의 증폭효과를 억제하였고 이는 염증세포들이 활성화되어 분비하는 H₂O₂등의 산화물들이 내독소로 유발된 염 증환경 내에서 산화질소 합성효소의 발현을 더욱 자극하여 염증반응을 증폭 및 진행시킬 수 있음을 시사한다. 또한 DEX는 내독소나 cytokine에 의한 산화질소 생성을 억제하는 것과 같이 iNOS mRNA 발현을 억제함으로써 내독소와 H₂O₂에 의한 산화질소 생성을 억제하고 이러한 결과로 볼 때 삼출성 중이염을 포함한 염증반응에서 iNOS를 선택적으로 억제함으로써 염증반응을 줄일 수 있을 것으로 생각되며 추후에 생체 내 중이염에서 산화질소의 역할과 DEX 및 항산화제의 효과를 알아보는 것이 필요할 것으로 생각된다.

결     론

   이상의 결과로 H₂O₂가 내독소로 자극된 마우스 대식세포에서 산화질소 생성에 유의한 증폭효과를 나타냈고 이것은 iNOS 유전자의 전사단계에서 작용했음을 확인할 수 있었다. 또한 DEX는 iNOS mRNA 발현을 억제함으로써 내독소와 H₂O₂자극에 의한 산화질소 생성을 유의하게 감소시켰으며, 항산화제는 내독소로 유발된 산화질소 생성에 대한 H₂O₂의 증폭효과를 억제하였다.

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