서     론

   두경부 영역의 악성종양은 수술이나 방사선요법 등 기존의 치료 이외에도 재발을 방지하거나, 이차 중복암의 고위험군에 대한 예방, 또는 진행된 병기 암을 효과적으로 치료하기 위하여 새로운 치료법이 요구되고 있다. 종양 환자의 면역기능이 저하되거나, 면역관계 세포의 종양 내 침윤 정도와 예후가 관계있는 점, 일부 종양에서의 면역치료의 시도 및 성과 등은 두경부 영역의 가장 흔한 악성종양인 편평세포암종에 대한 면역치료의 시도에 대한 충분한 가능성 및 타당성을 시사한다고 사료된다.
   한편, 수지상세포의 항원제공기능 및 세포성 면역 유도기능의 중요성이 밝혀지면서, 최근 수지상세포의 적절한 가공을 이용한 항암 치료의 시도나 cytokine 또는 종양관련항원 유전자를 수지상세포에 이입시키는 복합적인 시도가 활발하게 이루어지고 있다.¹⁾
   수지상세포는 골수에서 생성되어 조직으로 이주하면서 성숙되면 별모양의 긴 돌기를 갖는 특징적 형태의 커다란 세포가 되며, 항원을 인지하고 적절히 처리하여 T 세포의 면역반응을 유도하는 전문적이고도 가장 강력한 항원제공세포의 기능을 갖게 된다. 조직에서 발견되는 위치에 따라 Langerhans cells, interstitial DC, follicular DC, lymphoid DC 등으로 구분할 수 있다. 수지상세포의 표면에는 T 세포의 활성화에 필수적인 여러 accessory molecule 들이 풍부하고, T 세포의 분화와 성장에 관련된 여러 물질을 분비하며, 성숙된 수지상세포는 effector T 세포가 많은 림프조직으로 이동하는 등, 종양항원을 비롯한 항원 특이적인 면역반응의 첫 단계를 유도하는 가장 필수적인 세포로 이해되고 있다.²⁾
   수지상세포에 대한 최근 일련의 연구결과에 따라 기존의 cytokine을 이용한 면역치료의 한계를 극복할 수 있는 새로운 차원의 치료법이 활발히 연구되고 있다. 이에 저자들은 두경부 악성종양의 대부분을 차지하는 편평세포암종에 대한 수지상세포를 이용한 항암 효과 여부를 알아 보고자 하였다.

재료 및 방법

세포주 배양 및 동물내 주입

   편평세포암종을 만들기 위하여 본 실험에 사용된 SCC VII 세포주는 C3H/HeJ mouse에서 자연발생하는 편평세포암종으로부터 얻어진 세포주로서,³⁾ 서울대학교병원 이비인후과에서 보유하고 있는 세포주를 분주받아 본 실험에 사용하였다. 편평상피암 세포는 RPMI 1640 배양액에 10% FBS, 1% L-glutamine, 1% penicillin과 streptomycin 등을 첨가한 뒤, 5% 이산화탄소가 유지되는 37°C 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포주는 trypsin/EDTA를 이용하여 flask바닥에서 떼어낸 뒤, trypan blue exclusion을 이용하여 생존 해있는 세포를 평가한 후 배양액에 최종 농도 1×10⁶ cells/ml이 되도록 하였다.
   실험에 사용된 동물은 Jackson Immuno-Research Labs Inc.(West Grove, PA, USA)에서 분양받아 SLC(Japan)나 대한실험동물 센터에서 키우고 있는 암컷, 생후 5~6주령의 SPF, syngeneic C3H/He mouse를 이용하였다. 앞서 준비된 SCC VII 세포를 mouse의 등에 한 마리 당 1×10³, 1×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶개씩 피하 주사하고, 주사 후 4주까지 종양의 성립여부와 성장속도, 생존기간 등을 관찰하고 종양의 주위조직과 함께 절제하여 hematoxylin-eosin(H & E) 염색으로 편평세포암종의 확립을 확인하였다. 수지상세포의 배양은 주로 Inaba(1992)⁴⁾의 방법에 준하였으며, 수지상세포의 배양용기에 유착되는 특성을 이용하여 단핵구들을 분리 제거하였다. C3H/He mouse를 경추탈구 시킨 뒤 장골과 단골을 적출하여, 뼈의 양측 마디부분을 절단하고 10 ml 주사기를 이용하여 RPMI 1640 용액으로 골수를 flushing해 내었다. 추출물을 nylon mesh(size 50, Sigma, USA)로 걸러낸 뒤 0.8% ammonium chloride 10 ml로 현탁시킨 후 1,100 rpm에서 10분간 원심분리하여 적혈구를 제거하고, 두 번의 세척과정을 거친 뒤, T75 flask에 4×10⁷개의 세포를 심어 90분간 배양하였다.
   배양용기에 부착되지 않은 세포들을 10 ml의 RPMI 1640 용액으로 5번의 세척을 통해 제거한 뒤 ml당 1000U rmIL-4, rmGM-CSF가 첨가된 RPMI 1640 용액을 9 ml정도 넣어 배양하였다. 나흘 뒤 같은 농도의 cytokine이 든 배양액을 3 ml 첨가하여 3일간 더 배양하였다. 7일 째에 배양용기에 부착되지 않거나 단단하지 않게 부착된 세포들을 추출해 내고, 이 세포를 이용하여 유세포분석(flow cytometric analysis)을 통하여 표현형(phenotype)을 확인하고, 이종(Balb/C mouse) 단핵구를 반응(responder)세포로 이용한 allogeneic MLR을 통하여 기능을 평가하였다.

유세포분석

   수지상세포 배양 7일째 배양용기에 부착되지 않거나 단단하지 않게 부착된 세포들을 50 ml 원추형 용기에 모은 후 1,100 rpm에서 10분간 원심분리하여, 상층액을 제거한 뒤 1 ml의 PSA (2.5% horse serum, 0.005% NaN₃) 용액으로 세척한 후 세포의 수를 계수하였다. 100 l의 PSA용액에 105개의 세포를 희석해 Falcon 5402 tube에 분주한 뒤 각각 FITC 항체(CD11c, CD80, CD86, CD3, NLDC145)와 PE 항체(MHC class I, II, Mac-3) 1 l를 첨가하여(Table 1), 암소에 30분간 보관한 후 2 ml의 차가운 PSA용액을 첨가해 섞은 뒤 300 g에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 0.5 ml의 차가운 PSA용액에 현탁해 얼음에서 빛을 차단한 채로 보관한 뒤 분석은 FACScan flow cytometer(Becton-Dickinson, CA)를 통해 시행하였다.

Allogeneic MLR

   반응세포로 Balb/C mouse의 비장을 잘게 자르고 저민 후 mesh에 거르고 50 ml 용기에 모아 그 추출액을 1,100 rpm에서 10분간 원심분리한 뒤 10 ml의 0.8% ammonium chloride를 첨가하여 적혈구를 제거하였다. 세척과정을 거친 뒤, Falcon 96 well plate에 well당 2×105개의 세포를 RPMI 1640 용액 100 l에 희석시켜 분주하였다. 실험군의 자극(stimulator)세포로는 C3H mouse의 골수에서 배양된 수지상세포를 trypsin / EDTA를 이용하여 떼어내어 세척과정을 거친 뒤 mitomycin C 50 g/ml로 20분간 처리하여 사용하였다. 대조군의 자극 세포로는 C3H mouse의 비장에서 추출한 세포를 mitomycin C로 처리한 뒤 이용하였으며, 반응세포가 분주된 well당 실험군 및 대조군의 자극세포는 각각 1.25×10⁴, 2.5×10⁴, 5×10⁴ 세포씩 섞어 37°C에서 2일간 함께 배양하였다. 한 well당 1 Ci의 [³H]-thymidine을 첨가하여 18시간 추가 배양한 뒤 Liquid Scintillation Counter(Beckman LS6500, USA)로 [³H]-thymidine uptake의 정도를 측정하였다. 동일 농도 당 3 배수로 실험하여 그 평균값을 비교하였다.

수지상세포의 항암 면역효과 판정
   T75 flask에서 7일간 배양한 수지상세포를 trypsin/EDTA로 떼어 낸 뒤 종양세포를 피하에 주사한 지 10일 후부터 1주 간격으로 5~8×10⁵ 세포씩 3회에 걸쳐 복강 내 주사하였다. 치료군 및 비치료군 각 5마리씩을 대상으로 하였으며, 수지상세포의 주입을 위하여 주사 1회당 15~20마리의 골수에서 추출한 수지상세포를 7일간 배양한 뒤 치료군 5마리의 복강 내에 나누어 주입하였다. 수지상세포의 처치를 받지 않은 비치료군에 비하여 치료군에서 종양의 성장이 감소되거나 생존 기간에 차이가 있는 지를 비교하였으며, 종양의 병리조직학적 양상과 종양 내로의 면역관계 세포의 발현 정도를 비교하였다. 또한 각 군의 비장에서 추출한 림프구의 세포살해능력 또는 항원에 대한 증식능력에 차이가 있는지 비교하여 두 군간의 면역능력의 정도를 비교하였다.

종양의 크기 및 조직학적 비교

   종양의 소멸이나 크기의 감소를 주당 3회씩 caliper를 이용하여 종양의 직경중 최장경과 그에 수직되는 직경을 측정하고 곱하여 종양의 단면적(mm²)을 측정하였다. 최초의 수지상세포 주사로부터 4주까지의 결과를 바탕으로 두 군간의 종양 단면적을 비교하였다.
   효과판정이 끝난 종양조직의 H & E 염색을 통하여 종양의 특성이나 주위조직과의 관계에 특이한 차이점이 있는 지 비교하였으며, 면역조직화학 염색을 통하여 T 세포(CD4+, CD8+)와 수지상세포(CD11c+)의 종양 내 발현 정도를 비교하였다.
   면역조직화학염색을 위하여 조직은 생검직후 OCT compound (Tissue-tek, USA)에 포매한 후 -70°C에 보관하였으며, 염색시 동결절편기로 4 µm 두께로 박절한 뒤 슬라이드에 붙이고 2시간 실온에 방치하였다. 이후 -20°C의 alcoholic acetone으로 3~5분간 고정시킨 뒤 수돗물로 충분히 수세하여 OCT compound를 제거하였다. 말 혈청으로 5분간 반응시켜 비특이적 결합을 방지한 뒤, biotin이 결합된 antimouse CD4, CD8, CD11c 항체를 각각 1:100의 농도로 실온에서 2시간 반응시키고, tris buffer로 세척한 뒤 diaminobenzidine(DAB)를 이용하여 발색시키고 대조염색은 hematoxylin으로 하였다.
   종양 내로 침윤된 CD4+T 세포 및 CD8+T세포, 수지상세포의 수는 각 종양 조직 당 400배의 현미경 시야에서 무작위로 선택한 총 60개의 시야에서 계수하여, 치료군과 비치료군 간에 Student`s t-test를 이용하여 유의수준 95%를 기준으로 통계처리하여 비교하였다.

Mixed leukocyte tumor reaction (MLTR)
   SCC VII 세포주를 trypsin/EDTA로 떼어내고 50 ml의 용기에 모아 mitomycin C 50 g/ml로 20분간 처리한 뒤, 살아있는 세포의 수를 계수하여 Falcon 96 well plate에 well당 10⁵개의 세포를 RPMI 1640 용액100 l에 희석시켜 분주하였다. 치료군과 비치료군의 비장 및 종양세포에 노출된 경험이 없는 또 하나의 대조군 비장으로부터 allogeneic MLR 검사에서와 동일한 방법으로 splenocyte suspension을 만들어, SCC VII 세포가 분주된 well에 50×10³, 25×10³, 12.5×10³, 6.25×10³ 세포씩 섞어 37°C에서 2일간 함께 배양하였다. 동일 농도 당 3 배수로 실험하였으며, 한 well당 1 Ci의 [³H]-thymidine을 첨가하여 18시간 추가 배양한 뒤 Liquid Scintillation Counter(Beckman LS6500, USA)로 [³H]-thymidine uptake의 정도를 측정하였다.

Cytotoxicity assay
   Target 세포로는 배양된 SCC VII세포를 trypsin/EDTA를 이용하여 떼어낸 뒤 50 ml 원추형 용기에 모아 1% FBS가 든 RPMI 1640 용액 10 ml로 세척하여 원심분리한 뒤 세포의 수를 측정하여 동일한 용액 100 l에 10⁴개씩 희석시켜 사용하였다. 이를 Falcon 96 well plate에 분주한 뒤, effector 세포로서 치료군과 비치료군의 비장 및 종양세포에 노출된 경험이 없는 동종 mouse의 비장에서 추출한 splenocyte suspension을 다양한 비율(SCC VII:splenocytes ; 1:12.5, 1:25, 1:50)로 첨가하여 함께 37°C에서 4시간 배양하였다. Effector 세포의 자연적으로 유리되는 lactic dehydrogenase(LDH) 양을 측정하기 위하여 target 세포를 첨가하지 않고 effector 세포만 상기한 농도로 100 l의 용액에 희석시켜 각 well에 분주하였고, target 세포의 자연적 LDH 유리량 및 최대 LDH 유리량의 측정을 위하여 동일한 용액에 희석하거나, 1% triton X-100이 첨가된 용액으로 희석하여 분주하고 4시간 동안 함께 배양하였다. 96 well plate를 2,000 rpm에서 10분간 원심분리한 뒤 상층액 50 l를 취하여 발색물 50 l를 첨가해 30분 동안 암소에서 반응시킨 뒤 ELISA reader로 490 nm에서 optical density를 측정하였다. Target 세포와 effector 세포가 혼합된 well의 측정치에서 effctor 세포의 자연적 LDH 유리값을 뺀 뒤, target 세포의 최대 LDH 유리값과 자연적 LDH 유리값의 차이로 나누어 cytotoxicity(%)를 비교하였다. 모든 실험은 3배수로 측정하여 평균값으로 비교하였으며, LDH Cytotoxicity Detection Kit(Boehringer Mannheim)를 이용하였다.

결     과

   1×10⁵개 이상의 SCC VII 세포주를 주사한 모든 동물에서 종양의 생성이 확립되었다. 주사 4~6일째부터 2~3 mm 직경의 작은 결절형태로 종양이 만져지기 시작하였으며, 7~10일경에 직경 10 mm 내외의 크기로 성장함을 확인하였다. 주사한 세포주의 농도에 따라 10일경부터 종양의 크기에 차이가 나타나기 시작하였으며, 시간의 경과에 따라 종양의 단면적은 직선적인 성장곡선을 보였다(Fig. 1). 1×10⁵ 세포를 주사한 경우 주사 후 한 달 이상 생존하였으나, 5×10⁵, 5×10⁶ 세포를 주사한 경우는 17일째 사망하였고, 1×10⁶ 세포를 주사한 경우는 24일째 사망하였다.
   생성된 종양은 편평세포암종에서 특징적으로 관찰되는 keratin pearl이나 intercellular bridge 등은 관찰되지 않았으나, 세포질이 다각형이며 핵분열이 다수 관찰되었고, 개개의 세포가 분리되어 있는 특성과 핵모양이 편평세포암종에 유사한 특성이 있음이 관찰되었으며(Fig. 2), 경우에 따라서는 방추형의 세포들이 밀집되어 분포하고 혈관의 증식되는 양상은 sarcomatoid SCC에 가까운 특성을 보이는 부위도 관찰할 수 있었다. 종양세포 내로 림프구의 침윤도 관찰되었다.
   C3H mouse의 골수에서 추출한 세포는 대개 2~5×10⁷ 정도의 수가 얻어지며, 7일간 배양을 마치고 배양용기에 붙어있지 않거나 가볍게 붙어있는 세포는 2~3×10⁵정도의 수를 얻을 수 있었다. 배양과정에서 2일째부터 용기에서 떨어지기 시작하여(Fig. 3), 4~5일째에는 반 이상의 세포가 배양용액에 떠 있음을 확인할 수 있었다.
   배양 4일째부터 7일째까지 유세포분석을 시행하여 본 결과 배양 7일째 세포의 수는 다소 감소되지만, 세포의 크기가 커지면서 co-stimulatory molecule과 MHC의 발현이 높아짐을 관찰하였다. 용기의 바닥에 붙어있는 세포는 유세포분석상 분포되는 양상에 일관성이 없어서 여러종류의 세포가 혼재되어 있음을 알 수 있었으며, 배양용액에 떠 있거나 가볍게 바닥에 붙은 세포들이 일관된 분포를 보이고 DC 표지자의 발현율이 높음을 관찰하였다. T 세포 표지자인 CD3는 1% 내외로 거의 발현이 되지 않음을 확인하였고, B7-1, B7-2의 발현이나 MHC class I, II의 발현은 75% 내외로 높은 편이었으나 mouse DC의 표지자로 알려진 CD11c나 interdigitating DC의 표지자로 알려진 NLDC 145의 경우 발현율의 일관성이 떨어지거나 낮았으며, 거대탐식세포의 표지자인 Mac-3에 대한 발현도 14% 정도 관찰되었다(Table 2).
   Allogeneic MLR 검사상 첨가한 수지상세포의 농도의 증가에 따라 Balb/C mouse의 비장에서 추출한 림프구 증식의 자극이 증가됨이 관찰되었고, 모든 농도에서 대조군에 비하여 높게 관찰되었다(Fig. 4).
   수지상세포로 치료한 군과 치료받지 않은 군 각 5마리 중 3마리씩이 29일째까지 생존하였는데, 비치료군에서 실험 21, 26일째 한 마리씩 사망하였고, 치료군에서는 실험 26, 28일째 한마리씩 사망하였다. 실험 17일째부터 치료군에서 종양의 성장이 둔화되는 차이를 보이기 시작하여 29일째 종양의 크기는 비치료군 1,289 mm² (972~1,575 mm²), 치료군 665 mm²(552~750 mm²)으로, 치료군에서 종양의 성장이 둔화됨을 관찰하였다(Fig. 5).
   종양의 병리조직학적인 성장양상은 비치료군에서는 주변 조직으로의 침윤정도가 심하여 생존하였던 3마리 중 2마리에서 주위 근육으로의 매우 심한 침윤이 관찰되었으며, 그 중 1마리에서는 신장으로까지의 침윤이 관찰되었다(Fig. 6). 반면 치료군에서는 1마리에서만 경미한 정도의 주위 근육 침범이 관찰되었을 뿐 기타 다른 부위로의 침윤은 관찰되지 않았다.
   종양조직의 면역조직화학염색 검사상 400배 비율의 현미경 한 시야에서 CD4+T 세포(Fig. 7)는 치료군에서는 3.27±2.19개, 비치료군에서는 1.67±1.66개 관찰되었으며, CD8+T 세포(Fig. 8)는 치료군에서 13.97±7.24개, 비치료군에서 3.73±3.06개, CD11c에 양성으로 염색된 수지상세포(Fig. 9)는 치료군에서 4.21±2.46개, 비치료군에서 1.88±1.33개가 관찰되었다(Table 3). CD4+세포, CD8+세포 및 수지상세포가 모두 치료군에서 비치료군에 비교하여 통계적으로 의미있게 그 발현이 증가되어 있음을 확인하였다(p<0.01).
   비장에서 추출한 림프구에 종양세포를 함께 배양하여 림프구의 증식능력 정도를 검사한 MLTR 검사에서 수지상세포로 치료를 받았던 군의 비장세포의 경우 농도에 따라 30~267×10³ cpm의 [³H]-thymidine uptake가 관찰되었으며, 치료받지 않은 군의 경우 6~197×10³ cpm, 종양세포에 노출된 경험이 없는 또 하나의 대조군의 경우 4~66×10³ cpm으로 관찰되어 각 농도비에서 치료군의 경우가 가장 높은 결과치를 보였다(Fig. 10).
   비장에서 추출한 림프구에 종양세포를 함께 배양하여 림프구가 종양세포를 파괴시키는 cytotoxic T lymphocyte(CTL) activity를 측정한 결과, 수지상세포로 치료를 받았던 군에서 치료를 받지 않은 군이나 종양세포에 노출된 경험이 없는 대조군에 비하여 cytotoxicity(%)가 다소 높음을 확인하였으나(Fig. 11), 그 차이가 매우 적었으며 어느 경우나 10% 미만의 미약한 CTL activity만을 보임을 관찰하였다.
   이상의 결과를 요약하면, 첫째, C3H mouse의 편평세포암종 세포주를 이용하여 면역기능이 유지된 편평세포암종 동물모델을 확립하였으며, 둘째, 동종의 골수에서 수지상세포를 분리 배양하여 형태적으로 또한 기능적으로 항원제공세포의 역할을 담당할 수 있음을 확인하였다. 셋째, 골수에서 추출하여 배양한 수지상세포의 주입은 실험적으로 유발된 편평세포암종에 대하여 종양 성장 억제의 효과가 있으며, 수지상세포로 치료받은 군에서 종양세포에 대한 국소적, 전신적인 세포성 면역기능이 향상되어 있음을 확인하였다.

고     찰

   항암 유전자요법은 발암이나 항암기능의 근본기전을 유전자 수준에서 접근함으로써 기존의 방사선요법이나 수술요법이 갖는 한계를 극복하려는 새로운 치료 접근이라 요약할 수 있다. 하지만 oncogene이나 tumor suppressor gene의 조작을 통한 접근은 암세포 유전자의 대부분을 변화시켜야 하는 현실적인 어려움이 있어서, 암세포에 대한 면역기전을 활성화시킬 수 있는 면역요법 또는 유전자의 이입을 통하여 면역반응을 항진시키는 면역유전자요법이 그 대안으로 부각되고 있다.¹⁾ 암환자의 면역기능은 전반적으로 저하되어 있고, 암세포 자체도 항원성이 매우 낮음이 알려져 있어서,⁵⁾⁶⁾ 항암 면역반응이 효과적으로 일어나게 하기 위하여는 종양관련항원이 면역계에 충분히 전달될 수 있도록 유도할 필요가 있는데, 수지상세포는 이러한 항원의 전달 과정에 가장 중요하고도 강력한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.²⁾
   두경부영역의 악성종양이 대부분 편평세포암종이므로 편평세포암종 동물모델은 이비인후과 영역에서는 특히 중요하다고 할 수 있다. 본 실험에서 사용된 C3H mouse는 동종(syngeneic)이면서 면역기능이 유지(immunocompetent)되어 있어 면역치료의 가능성을 검증하기 위한 적절한 실험동물이라 사료된다. 1×10⁵개 이상의 SCC VII 세포주를 주사한 모든 실험동물에서 안정되게 편평세포암종이 확립되었으며, 비교적 빠른 시간(7~10일)에 직경 10 mm크기의 종양이 생성되며, 특히 1×10⁵ 세포를 주사한 경우 직선에 가까운 종양의 성장양상을 보이고 한 달 이상의 생존기간을 보여 면역요법 등의 실험을 위한 적합한 편평세포암종 동물모델이라 생각되었다.
   수지상세포의 배양 및 확인의 어려운 점은 많은 수의 세포를 얻기가 어렵고, 진단적 가치가 높은 특이적 표지자가 없다는 점을 들 수 있다. 본 실험에서도 한 마리의 C3H mouse의 골수에서 약 2~3x10⁵ 개의 수지상세포를 얻어 상대적으로 적은 수의 소득이라 생각되었으며,⁷⁾ 이는 단핵구들을 제거하기 위한 기법으로 수지상세포가 flask에 초기에 유착되는 성질을 이용하였는데, 이 과정에서 세포의 양적 손실이 있지 않았나 사료된다.
   본 실험의 예비실험 과정에서 수지상세포는 배양과정 중 점차 분화되어 7일째에 양적으로나 기능적으로 실험에 가장 적절한 상태가 됨을 확인한 바 있으며, 7일째에 바닥에 유착되지 않거나 가볍게 붙어있는 세포들이 유세포분석상 비교적 일관되고, co-stimulatory molecule의 발현이 가장 뛰어난 상태가 됨을 확인하였다. 수지상세포로의 분화를 유도하기 위하여 GM-CSF와 IL-4를 사용하였는데, 기존의 많은 연구에서 TNF-α를 이용한 배양기법이 소개된 바 있어,⁸⁾ 어떠한 조건에서 가장 뛰어난 항원제공기능을 갖는 지 검정할 필요가 있으리라 사료된다.
   유세포분석 결과 co-stimulatory molecule과 MHC의 발현은 상대적으로 높게 나타났으나 mouse 수지상세포의 표지자로 비교적 알려진 CD11c의 경우는 수 차례의 반복된 실험에도 불구하고 최대 43%를 넘지 못하는 등 반응의 정도가 낮게 나타나 그 해석을 어렵게 하고 있다. 한편 거대탐식세포의 표지자로 알려진 Mac-3의 발현이 5~21%로 나타나 본 실험에서 응용된 배양기법으로는 일부 거대탐식세포로의 분화가 일어나거나 일부 상호교차반응이 일어나기 때문으로 생각되었다. 하지만 거대탐식세포 역시 항원제공세포의 기능을 갖기 때문에 항암 면역반응을 유도하는 취지에는 큰 무리가 없으리라 생각되었다.
   수지상세포를 복강내 주사받은 치료군이나 비치료군 모두 5마리 중 3마리가 실험 4주째까지 생존하였으나 치료군에서 주위조직으로의 침윤이 적고, 비치료군에 비하여 종양의 크기가 작아 종양 성장 억제의 효과가 있는 것으로 판정하였다. 하지만 실험대상 수가 적어서 통계적인 유의성을 검정하기에는 무리가 있으리라 사료되며, 종양이 완전히 소실되거나 종양의 크기가 감소되는 결과를 얻지는 못하여 단순히 배양된 수지상세포의 주입만으로는 항암 효과가 불충분하거나 미약한 것으로 사료되었다. 이는 기존의 연구에 비교할 때 종양이 너무 크게 자란 이후에 수지상세포를 주입하는 등 시기가 부적절하였거나, 주입의 횟수나 양의 부족, 또는 주입경로가 부적절하였다고 해석하여 볼 수도 있겠다.
   종양 내로의 수지상세포 및 CD4+세포, CD8+세포의 침윤이 치료군에서 의미있게 증가한 반면, 종양의 소실이나 크기의 감소는 관찰할 수 없었으며, 비장에서 추출한 세포의 SCC 종양세포에 대한 CTL activity의 뚜렷한 증가를 관찰할 수는 없었는데, 이는 수지상세포의 주입으로 전반적인 면역기능의 항진은 기대할 수 있으나 종양항원에 대한 특이적인 기능항진을 기대하기는 어렵기 때문으로 사료된다. 따라서 항암 효과를 극대화하기 위하여는 수지상세포의 주입 이전에 종양관련항원에 노출시켜 종양항원을 충분히 림프구에 제공할 수 있도록 수지상세포의 기능을 특화시키는 과정이 필요하다고 생각된다.
   종양항원을 수지상세포에 노출시키는 과정은 종양의 RNA 또는 DNA를 이용하는 방법, 종양세포와의 융합법, 종양특이 펩타이드를 이용하는 방법, 종양추출물을 만들어 단백의 형태로 이용하는 방법 등이 있으며,⁹⁾ 종양특이항원의 염기서열을 모르거나 정제가 곤란한 경우에는 종양추출물을 이용하는 것이 쉽고도 실질적인 방법이 될 수 있으며, 동물모델에서 이를 이용한 효과적인 예방백신의 결과가 보고된 바 있다.¹⁰⁾ 실제로 종양추출물을 이용하는 방법은 이미 형성된 편평상피암을 절제해 내어 slush 상태가 되도록 잘게 자르고 동결, 해동 과정을 반복한 뒤 수지상세포의 배양용기에 첨가하여 밤새 배양시킴으로써 가능하며, 이러한 과정은 수지상세포의 편평세포암종에 대한 항암 면역효과를 증진시키는데 필수적인 단계일 것으로 사료된다.

결     론

   편평세포암종에 대한 항원제공세포를 이용한 면역요법의 가능성을 확인하기 위하여, 면역기능이 유지된 편평세포암종 동물모델을 만들고, 골수 수지상세포를 배양하여 이를 편평세포암종 모델에 주입함으로써 항암 효과가 있는지 살펴보고자 하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
   첫째, 1×10⁵개의 SCC VII 세포주를 피하주사하여 면역기능이 유지된 C3H mouse에서 편평세포암종을 일관되게 확립할 수 있었으며, 7~10일경 직경 약 10 mm 크기의 종양이 형성되어, 시간이 경과함에 따라 한 달간 직선에 가까운 성장을 보임을 관찰하였다.
   둘째, C3H mouse의 골수에서 특징적 형태의 수지상세포를 마리당 2~5×10⁵개 배양할 수 있었으며, 배양된 세포는 co-stimulatory molecule과 MHC class I, II의 발현이 70% 이상으로 높게 측정되었다. Allogeneic MLR 검사상 대조군에 비하여 효과적으로 림프구의 증식을 초래하여 항원제공세포로의 기능이 뛰어남을 확인하였다.
   셋째, 수지상세포를 복강 내 주사한 경우 실험 4주째 종양의 단면적은 평균 665 mm²으로 비치료군 1,289 mm²에 비하여 종양의 성장이 둔화었으며, 조직학적으로는 주위조직으로의 침윤이 적음을 확인하였으나 종양의 소실은 관찰할 수 없었다. 수지상세포를 주입한 군에서 종양조직 내부로 수지상세포나 CD4+, CD8+T 림프구 등 세포성 면역과 관계된 세포의 발현이 비치료군에 비하여 유의하게 증가됨을 확인하여(p<0.01), 종양조직에서의 국소적 면역반응이 증진되어 있음을 확인하였다. 치료군의 비장에서 추출한 림프구는 비치료군이나 대조군에 비하여 종양세포에 대한 증식능력은 증가되어 있었고, 살해능력은 10% 미만으로 그 차이가 미약하게 관찰되었다.
   본 실험을 통하여 얻어진 수지상세포의 배양기법 및 편평세포암종 모델은 면역기능이 유지된 동물에서 확립되었다는 점에서 향후 두경부암 및 면역요법과 관련된 연구에 유용하게 이용될 수 있으리라 사료된다.
   수지상세포의 주입으로 편평세포암종의 성장이 둔화되며, 종양세포에 대하여 국소적, 전신적 면역기능이 향상됨을 관찰할 수 있었던 본 연구의 결과는 편평세포암종 환자에서 항원제공세포를 이용한 항암 면역요법이나 면역유전자요법의 임상응용 가능성을 시사하는 것으로 생각된다. 하지만 종양의 완전한 소실이나 크기의 감소를 관찰할 수 없었던 바, 이는 향후 치료횟수나 치료시기, 주입경로와 같은 방법상의 수정과 더불어 수지상세포를 종양관련항원에 특화시키는 과정의 추가와 보완이 필요함을 의미하는 결과라 사료된다.

1. Tuting T, Storkus WJ, Lotze MT. Gene-based strategies for the immunotherapy of cancer. J Mol Med 1997;75:478-91.

2. Thomas R, Lipsky PE. Dendritic cells: origin and differentiation. Stem Cells 14; 1996. p.196-206.

3. O'Malley BW Jr, Cope KA, Johnson CS, Schwartz MR. A new immunocompetent murine model for oral cancer. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1997;123:20-4.

4. Inaba K, Inaba M, Romani N. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med 1992;176:1693-702.

5. Katz AE. Update on immunology of head and neck cancer. Otolaryngol Clin North Am 1993;77:625-31.

6. Whiteside TL, Letessier E, Hirabayashi H, Vitolo D, Bryant J, Barnes L, et al. Evidence for local and systemic activation of immune cells by peritumoral injections of interleukin 2 in patients with advanced squamous cell carcinoma of the head and neck. Cancer Res 1993;53:5654-62.

7. Zorina T, Mayordomo JI, Watkins S. Culture of dendritic cells from murine bone marrow supplemented with GM-CSF and TNF-alpha. J Immunother 1994;16:247.

8. Jonuleit H, Knop J, Enk AH. Cytokines and their effects on maturation, differentiation and migration of dendritic cells. Arch Dermatol Res 1996;289:1-8.

9. Shurin MR. Dendritic cells presenting tumor antigen. Cancer Immunol Immunother 1996;43:158-64.

10. Nair SK, Snyder D, Rouse BT, Gilboa E. Regression of tumors in mice vaccinated with professional antigen-presenting cells pulsed with tumor extracts. Int J Cancer 1997;70:706-15.