서     론

   지난 수십 년간 삼출성 중이염의 병인에 대한 많은 연구가 있어왔으며, 이관 폐색, 세균 감염에 의한 직접적인 염증 반응, 세균 항원에 의한 국소 면역반응, 중이내 알러지 반응 등이 삼출성 중이염의 발생과 유지에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이중에서 감염이나 이관 폐색으로 인한 염증대사물의 중이내 저류가 만성적인 삼출액 형성에 있어서 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있고, 중이내에서 이러한 세포매개성 반응은 삼출액내 호중구, 림프구, 대식세포, 항체, cytokine 등이 발견됨으로써 입증되고 있다.¹⁾ 
   염증 반응의 매개체이자 면역반응의 조절자의 역할을 하는 cytokine은 발열 반응, 파골세포(osteoclast)를 통한 골 파괴, 섬유아세포를 통한 섬유화, 조혈세포의 증식, 식균작용의 활성화, 항체생성의 조절 등, 우리 체내에서 일어날 수 있는 다양한 반응에 관여한다고 한다.¹⁾ 최근 들어 삼출성 중이염의 기전으로 지속적인 국소 염증반응이 알려져 있으며 이에 관여하는 cytokine의 중요성이 부각되고 있다.²⁾ 
   종양괴사인자(tumor necrosis factor；TNF)는 1975년 종양의 괴사를 일으키는 endotoxin-induced serum factor로 처음 알려진 이래로 여러 가지 감염이나 종양에 대한 면역체계에서 중요한 인자로 인식되고 있을 뿐만 아니라 염증반응의 강력한 매개체인 것으로 밝혀졌다.³⁾ 이러한 종양괴사인자는 호중구를 활성화시키고 림프구에서 세포간 접착분자(intercellular adhesion molecule)의 생성을 유도하며 interleukin(IL)-1, 2, 6, 8 등의 다른 cytokine뿐만 아니라 collagenase 등의 효소, 프로스타글란딘 등의 아라키돈산 대사물의 생성을 촉진시키는 것으로 알려져 있는데, 대식세포에서 분비되는 것으로 알려진 종양괴사인자-α(TNF-α)와 림프구에서 분비되는 종양괴사인자-β(TNF-β)로 분류되어진다.¹⁾³⁾ TNF soluble receptor type I(TNFsolRI)은 세포막에 있는 종양괴사인자 수용체와 경쟁적으로 종양괴사인자와 결합하여 종양괴사인자의 생리적 작용을 차단하는 물질로서 최근 들어 여러 질환의 모델에서 질환의 치료에 이용하려는 시도가 늘고 있다.^4-6) 
   이에 저자는 종양괴사인자-α를 고막내로 주입함으로써 성숙한 흰쥐의 정상 중이강에 삼출성 중이염을 유발하였으며, 이로 인한 중이 점막의 변화를 조직학적으로 확인하고 염색약을 이용한 혈관투과성의 변화를 관찰하여 삼출성 중이염의 발생에서 종양괴사인자-α의 역할 및 중이 점막에 어떠한 변화를 일으키는지를 밝히고 동시에 이것을 차단함으로써 삼출액의 발생을 막을 수 있는지 규명해 보고자 본 연구를 시행하였다.

재료 및 방법

재  료

   동일조건 하에서 사육한 체중 200~250 g의 성숙한 흰쥐(Sprague-Dawley rat)를 각 군당 10귀씩 사용하였으며 모두 수술용 현미경으로 건강한 외이와 중이를 확인하였다.
   동물은 ketamine hydrochloride(케타라, 유한양행) 50 mg/kg와 xylazine(럼푼, Bayer) 5 mg/kg을 근육주사하여 마취하였다. 시약은 수술용 현미경하에서 micropipette에 연결된 가느다란 유리관을 이용하여 고막을 천자한 후 중이강내로 투여하였다. 제 1 군은 대조군으로서 종양괴사인자-α(Biosource, Camarillo, California, USA)에 대한 용매로 사용된 멸균 증류수가 중이염의 발생에 미치는 영향을 배제하기 위하여 고막천자 후 멸균 증류수를 10 μl 투여하였다. 제 2 군은 고막내로 중이강에 종양괴사인자-α 5 μg (0.5 μg/μl)을 투여하였다. 제 3 군은 TNFsolRI(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA) 50 μg(200 μg/ml)을 먼저 고막내로 투여하고 나서 바로 종양괴사인자-α 5 μg(0.5 μg/μl)을 투여하였다. 혈관투과성의 변화를 알아보기 위한 방법으로 사용된 Evans blue dye(Sigma Chemical, St. Louis, Missouri, USA)는 생리 식염수에 녹여 50 mg/ml의 농도로 만들어 사용하였다.

조직 고정 및 표본 제작

   종양괴사인자-α를 흰쥐의 중이강에 투여한 지 24시간 뒤에 전신마취시킨 후, Evans blue 용액 0.5 ml를 꼬리의 정맥내로 주입하였다. 30분 후 수술용 현미경하에서 고막을 제거한 후 micropipette을 이용하여 삼출액을 확인 및 수거하였다.
   흉부를 절개하여 심장을 노출시킨 후 복강을 열고 양측 신동맥을 절제하여 체내의 혈액을 모두 제거하면서 좌심실에 카테터를 삽입하여 생리식염수를 관류한 후 두부를 분리시키고 중이 점막이 붙은 채로 측두골을 적출하였다. 적출된 조직은 10% paraformaldehyde(Sigma, St. Louis, Missouri, USA)로 24시간 고정 후 0.1M EDTA 용액(Sigma, St. Louis, Missouri, USA)에서 약 3~4주간 탈회하였으며, 파라핀에 포매된 조직을 4 μm 두께로 박절하여 슬라이드에 부착시켜 조직절편을 만들고 파라핀을 제거한 후, 전반적인 중이 점막의 변화를 관찰하기 위하여 Hematoxylin-Eosin 염색을 하였다. 혈관투과성의 변화는 10 μm 두께로 박절한 조직을 슬라이드에 부착하여 파라핀만을 제거한 후 염색 없이 광학 현미경으로 관찰하였다.

결과 판정

상피하층의 두께 측정
   각 개체에서 중이 점막의 기저막이 뚜렷하게 관찰되는 조직절편을 각각 10개씩 선택하였다. 중이 갑각을 덮고있는 점막중 가장 두꺼운 점막상피의 기저막에서부터 중이갑각의 골막까지의 두께를 400배 시야에서 측정하였는데, 접안렌즈에 표시되어있는 scale bar를 이용하였다. 각 개체의 평균 두께는 10개의 조직절편에서 측정한 수치를 평균하였고, 각 군의 평균 두께는 10개체의 수치를 평균하였다.

침윤된 염증세포의 정도와 종류 측정
   상피하층의 두께를 측정한 동일한 절편에서 중이갑각을 덮고있는 점막을 400배 시야에서 관찰하였다. 접안렌즈에 표시되어있는 2.5×2.5 μm 2 크기의 격자를 점막 기저막에 맞추고 격자 안의 세포 수를 세었다. 이때 격자선에 세포가 놓인 경우 상측과 좌측 선에 걸린 것은 포함하였고 하측과 우측 선에 걸린 것은 제외하였다. 염증세포 수는 10개의 조직절편에서 측정한 수치의 평균으로 하였고, 각 군의 평균 염증세포 수는 10개체의 수치를 평균하였다.

혈관투과성 변화

   정성적 판정을 위하여 조직절편에서 파라핀을 없앤 뒤 광학 현미경으로 관찰하였고, 보다 정확한 관찰을 위하여 형광현미경(Axiphot, Zeiss, Baden-Wuerttemberg, Stuttgart, Germany)을 이용하여 546 nm하에서 적색 형광을 보이는 Evans blue의 염색 유무와 부위를 관측하였다. 조직내로 유출된 Evans blue를 정량화하기 위하여 중이갑각 부근의 점막을 2×2 mm² 크기로 잘라서 formamide(Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland, USA) 0.5 ml에 넣어 50 °C하에서 24시간동안 두었다가 formamide 용액층을 얻어 분광광도계(Ultraspec 3000, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)를 이용하여 612 ㎚하에서 흡광도를 측정하였다. 이때 대조는 formamide 용액을 사용하였다.

통  계

   두 군간의 계측치의 비교는 Wilcoxon's signed ranks test를 시행하였고 통계 프로그램은 SPSS for Windows(Release 7.0, SPCC Inc, Chicago, Illinois, USA)를 이용하였다.

결     과

중이삼출액의 발생

   고막천자를 통하여 종양괴사인자-α를 투여한 지 24시간만에 10례중 7례(70%)에서 삼출액이 관찰되었다. 대조군에서는 삼출액이 발생하지 않았다. TNFsolRI 전처치 후 종양괴사인자-α를 투여한 군에서는 모두 삼출액이 관찰되지 않았다.

각 군간의 조직 비교

상피하층의 두께 비교(Fig. 1)
   대조군의 상피하층의 평균 수치는 2.39±0.25 μm였다. 종양괴사인자-α를 투여한 군에서는 모든 예에서 상피하층의 두께가 증가하였는데, 평균 수치는 82.50±4.86 μm로서 대조군보다 의미 있게 높았다(p<0.05). TNFsolRI 전처치 후 종양괴사인자-α를 투여한 군에서는 1례를 제외한 나머지 예에서 상피하층의 두께의 증가가 심하지 않았는데, 이 9례(90%)의 평균 수치는 30.25±1.08 μm였으며 이는 종양괴사인자-α를 투여한 군보다 의미있게 낮았다(p<0.05). 나머지 1례의 두께는 77.34 μm였다.

침윤된 염증세포의 정도와 종류 비교(Figs. 2 and 3)
   격자당(2.5×2.5 μm² ) 상피하층에 침윤된 염증세포 수는 대조군에서 3.00±0.37개였고 이중 호중구는 1.90±0.57개로서 전체 염증세포의 70.67±27.21%를 차지하였다. 종양괴사인자-α를 투여한 군에서 침윤된 염증세포는 15.20±0.66개였고 이중 호중구는 11.42±0.41개로서 전체 염증세포의 76.91±5.20%를 차지하였는데, 이는 대조군에서의 호중구 비율보다 통계학적으로 의미 있게 높지 않았다(p＝0.386). TNFsolRI 전처치 후 종양괴사인자-α를 투여한 군에서 침윤된 염증세포는 5.10±0.84개였고 이중 호중구는 2.50±0.05개로서 전체 염증세포의 65.15±12.45%를 차지하였으며, 이는 종양괴사인자-α를 투여한 군에서의 호중구 비율보다 의미 있게 낮지 않았다(p＝0.445). 상피하층에 침윤된 염증세포의 수는 종양괴사인자-α 투여군에서 대조군보다 의미있게 높았고, TNFsolRI 전처치 후 종양괴사인자-α를 투여한 군에서는 종양괴사인자-α 투여군보다 의미 있게 감소하였다(p<0.05, p<0.05, respectively).

각 군간의 혈관투과성의 변화(Fig. 4)
   대조군의 조직에서는 Evans blue dye의 조직내 유출을 거의 찾아볼 수 없었으며 조직내 Evans blue의 흡광도는 612 nm에서 0.180±0.09이었다. 종양괴사인자-α를 투여한 군의 조직에서는 세동·정맥과 모세혈관 주변 및 상피하층에서 Evans blue가 관찰되었는데, 이는 광학 현미경하에서는 청색으로 관찰이 되었고 자외선하에서는 적색 형광을 보였다. 흡광도는 0.370±0.03으로 나타나 대조군의 것보다 높았으나 통계적으로 유의한 차이는 없었다(p＝0.074). TNFsolRI 전처치 후 종양괴사인자-α를 투여한 군에서는 일부에서 세동·정맥 주변으로 Evans blue가 관찰되었으나 점막의 형광정도는 전반적으로 대조군의 것과 유사하였고 흡광도는 0.220±0.08이었으며, 이는 종양괴사인자-α를 투여한 군의 것보다 낮았으나 통계적으로 의미 있는 차이는 없었다(p＝0.074).

고     찰

   삼출성 중이염과 cytokine간의 연관성을 입증하는 연구들은 많이 시행되어 왔는데, 삼출성 중이염을 앓는 환자에서 삼출액을 수거하여 그 삼출액에 존재하는 cytokine을 검출하는 방법을 통하여 1988년 Ophir 등³⁾은 삼출액내 종양괴사인자의 존재를 확인하였고, 1991년 Yellon 등¹⁾은 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)를 이용하여 IL-1, IL-2, IL-6, 종양괴사인자, interferon-γ의 존재를 밝혔다. 1997년 Maxwell 등⁷⁾은 삼출성 중이염을 앓는 환자에서 삼출액을 수거하여 ELISA와 radioactive immunoassay를 이용하여 종양괴사인자-α와 TNF soluble receptor를 검출하여 이 둘간의 상호작용으로 인하여 삼출액이 형성 및 유지된다고 밝혔다. 실험적으로 삼출성 중이염을 유발한 경우로는 1991년 Catanzaro 등²⁾이 IL-2, 종양괴사인자를 정상 guinea pig의 고막을 천자하여 중이강내 투여하여 삼출성 중이염이 유발됨을 확인하였고, 1993년 Rhee 등⁸⁾은 혈소판활성인자로 유발한 삼출성 중이염에서 혈소판활성인자가 삼출액 생성에 관여함을 밝혔다. 1997년 Ball 등⁹⁾은 내독소를 정상 흰쥐의 고막을 천자하여 중이강내 투여하여 유발시킨 삼출성 중이염에서 종양괴사인자를 확인하여 종양괴사인자가 삼출성 중이염에 관여함을 밝혔다.
   그러나 이러한 방법들은 대개 삼출액내에서 여러 가지 cytokine의 존재를 입증하는 데에만 중점을 두고 있는 정도여서 삼출액 형성에 미치는 영향이나 그 인과관계를 밝히는 데에는 미흡한 점이 있다. cytokine으로 실험적 중이염을 유발하여 그 인과관계와 결과를 관찰한 보고로는 Catanzaro 등과 Rhee 등이 있다. Catanzaro 등²⁾은 IL-1, IL-2, 종양괴사인자를 guinea pig의 고막천자를 통하여 중이내 투여하여 삼출액내 이들의 농도변화와 삼출된 염증세포의 종류를 관찰하였으며, 종양괴사인자는 10 μg을 사용하였고 투여 12시간부터 삼출액이 생기기 시작하여 24시간에 최고치를 보였고 48시간 후에는 정상 범주로 감소함을 관찰하였으며 투여 24시간 후에 가장 많은 염증세포는 다형핵세포와 대식세포임을 확인하였다. 본 연구에서는 종양괴사인자-α를 투여한 지 24시간만에 10례중 7례(70%)에서 삼출액이 생성되었음을 확인하였고 전 예에서 중이점막내 조직학적 변화를 확인할 수 있었다. 3례에서 삼출액을 확인 못한 것은 수술용 현미경하라도 관찰 가능한 양보다 적은 양이 생성되었거나 실험동물의 마취과정에서 이관을 통하여 유실되었기 때문일 것으로 추정된다.
   Evans blue dye는 미세혈관의 투과성 변화를 알아보는데 널리 쓰이는 방법으로서, 혈액순환내로 들어가면 혈청단백질, 특히 알부민과 결합하여 복합체로 존재하게 된다. 염증 등으로 인하여 모세혈관의 투과성이 증가할 경우 단백질의 혈관외 유출이 일어나면서 단백질-Evans blue dye 결합체가 조직내에 침착하게 된다. 혈관에서 조직내로 빠져나온 Evans blue dye는 조직내에서 강한 적색 형광을 보이기 때문에 쉽게 정성화할 수 있을 뿐더러, 조직내에서 formamide로 Evans blue dye를 추출하여 분광광도계로 그 농도를 측정함으로써 간접적인 정량화도 가능하다. 본 연구에서도 대조군의 조직과 TNFsolRI 전처치 후 종양괴사인자-α를 투여한 군의 조직에서는 조직내 염색약의 유출이 거의 관찰되지 않았고 종양괴사인자-α를 투여한 군의 조직에서는 세동·정맥과 모세혈관 주변 및 상피하층에서 Evans blue dye가 관찰되었다. 또한 Evans blue dye를 추출하여 분광광도계에서 흡광도를 측정하여 정량비교가 가능하였다. 그러나 조직내 염색약의 유출의 차이를 일반 광학현미경하에서 관찰하는 것은 매우 힘들며, 조직내 유출된 염색약의 양이 소량이므로 장기에서 육안으로 확인하는 것과는 달리 어려울 뿐더러 부정확하다. 따라서 본 연구에서 사용한 방법처럼 형광 현미경을 이용한 정성적 분석과 함께 분광흡도계를 이용한 정량적 분석을 병행하는 것이 보다 정확한 접근이 될 것으로 생각된다. 본 연구에서 흡광도, 즉 조직내 유출된 염색약의 양은 종양괴사인자-α를 투여한 군에서 대조군이나 TNFsolRI 전처치 후 종양괴사인자-α를 투여한 군의 것보다 높았으나 통계적으로 의미 있지는 않았다.
   중이의 점막은 다른 호흡기, 소화기 등과 마찬가지로 자체의 면역체계를 갖고 있다.¹⁰⁾¹¹⁾ 삼출성 중이염은 중이내에 잔존하는 항원에 의해 유도된 면역반응에 의해 활성화된 림프구와 대식세포간의 상호작용에 의한 결과라고 생각할 수 있는데,¹²⁾ 현재까지 중이내 림프구­대식세포간의 상호작용에 관여하는 것으로 알려져 있는 cytokine으로는 IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, 종양괴사인자 등이 있다. 또한 림프구, 대식세포 등의 염증세포나 모세혈관들은 중이 점막내 상피하층에 분포되어 있기 때문에 이 상피하층이 중이 점막의 첫번째 면역방어선이자 삼출성 중이염에서의 첫번째 반응장소로서 그 중요성이 강조되고 있다.¹¹⁾¹³⁾ 특히 삼출성 중이염에서 유도된 면역반응에 의한 삼출액의 생성은 상피하층내 혈관투과성의 증가와 이로 인한 삼출액의 조직내 유출, 결과적인 상피하층의 확대 등이 특징이며, 이는 상피와 분비선의 증식과 섬유화, 골 파괴 등을 특징으로 하는 만성 중이염과 구분된다.¹³⁾ 따라서 삼출성 중이염에서 특징적으로 보이는 조직학적 소견은 모세혈관의 확장, 혈관충혈, 상피하층 부종으로 인한 점막두께의 증가이다.^13-16) 본 연구에서 종양괴사인자-α를 투여한 군에서 상피하층 두께의 평균 수치는 대조군보다 의미 있게 높았으며, TNFsolRI 전처치 후 종양괴사인자-α를 투여한 군에서는 종양괴사인자-α를 투여한 군보다 의미 있게 낮았다.
   종양괴사인자는 내독소를 투여 받은 동물에서 종양의 출혈성괴사를 유발하는 물질로서 발견된 이래로 체내의 염증반응에서 중요한 역할을 하는 cytokine으로서 종양괴사인자-α는 호중구와 혈관내피세포에 작용하는 것으로 알려져 있으며 특히 호중구의 이동에 관여한다는 것이 밝혀져 있다.¹⁵⁾ 또한 모세혈관의 혈관투과성에도 변화를 주는 것으로 알려져 있는데, 이러한 사실은 종양괴사인자-α를 주사한 조직에서 정맥의 국소적 파괴, 혈관내피세포의 소실, 세포기저막의 소실 등의 소견이 전자현미경하에서 관찰됨으로써 알게 되었다.^14-16) 그리고 1995년 Edamitsu 등은 유지질다당질(lipopolysaccharide) 투여 후 2~12시간내 염증세포의 침윤, 특히 호중구의 침윤과 Evans blue dye를 이용하여 증가된 혈관투과성을 관찰하고 종양괴사인자-α와의 관련성을 보고하면서, 종양괴사인자-α로 인한 혈관투과성의 변화는 호중구의 활성화와 호중구에서 유리되는 효소에 의해 중개된다고 주장하였다.¹⁴⁾ 본 연구에서도 상피하층에의 호중구의 침윤 정도를 비교하였는데, 대조군이나 TNF solRI 전처치 후 종양괴사인자-α를 투여한 군에서 침윤된 염증세포 중 호중구의 비율은 종양괴사인자-α를 투여한 군보다 낮았으나 의미 있는 차이를 보이지 않았다.
   TNF soluble receptor type I(TNFsolRI)은 체내에 정상적으로도 존재하는 cytokine 수용체로서 세포 외에 존재하며 cytokine의 생리적 작용을 조절하는 기능을 갖는다.^4)5)17)18) 이러한 TNF soluble receptor는 60 kDa(p60)의 TNF solRI과 80 kDa(p80)의 TNFsolRII로 구분되며, type II보다는 type I이 더욱 강력한 작용을 나타낸다.¹⁸⁾ 이러한 TNF soluble receptor는 종양괴사인자에 대해서 세포막에 존재하는 수용체와 경쟁적으로 결합하여 종양괴사인자의 생리적 작용을 차단시킨다고 알려져 있으며,^4)5)17)19) 특히 TNFsolRI는 유지질다당질로 유발된 폐의 급성 염증반응을 호중구의 작용과 침윤을 차단함으로써 억제시킨다는 사실이 보고되었다.⁶⁾ Ball 등은 종양괴사인자 결합 단백질(TNF binding protein)을 투여하여 종양괴사인자에 의한 삼출액 생성을 차단함으로써 삼출성 중이염의 치료에 대한 새로운 가능성을 제시하였고⁹⁾ 새앙쥐에서 유지질다당질로 유발된 패혈증을 TNF soluble receptor로 억제할 수 있다는 동물실험도 보고되고 있어 질환에의 응용의 가능성을 시사하고 있다.^4)5)17) 본 연구에서도 비록 중이강내로 국소적으로 투여하기는 하였으나, TNFsolRI를 이용하여 상피하층의 두께 감소, 염증세포의 침윤 감소, Evans blue dye의 유출 감소를 확인하였다. 그러나 기대와는 달리 염증세포내 호중구의 차지 비율의 의미 있는 차이는 보이지 않았다.

결     론

   종양괴사인자-α를 흰쥐의 중이에 주입하여 삼출성 중이염을 유발시키고 중이점막에 미치는 영향을 조직학적 및 혈관투과성 검사로 관찰하여 종양괴사인자-α가 삼출성 중이염의 발생 기전에 중요한 염증성 매개체중의 하나임을 확인하였으며, 또한 tumor necrosis factor soluble receptor type I을 중이내로 투여하여 삼출성 중이염의 생성을 차단함으로써 향후 임상적인 치료에 도움이 될 것으로 사료된다.

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