서     론

   후두 편평세포암종은 국소성이 높은 암종이지만 침습도와 원발병소의 미세한 환경과 림프조직의 분포에 따라 경부전이를 초래하여 높은 이환율과 사망률을 갖는 질환으로서 치료법의 많은 발달에도 불구하고 아직도 만족 할 만한 결과를 얻지 못하고 있다. 종양 환자의 치료 계획을 세우는데는 종양의 생물학적 특성과 예후를 객관적으로 예측하는 것이 매우 중요하며 예후를 결정 짓는 요소를 알기 위해 분자생물학적 지표에 관하여 많은 연구가 되어지고 있으나, 예후 인자로서의 유용성이 있음을 시사하는 보고도 있으나 결정적인 예후 인자는 아직 알려져 있지 않다.¹⁾
   Cyclin은 cyclin-dependent kinase(CDKs)와 복합체를 형성하여 유핵세포의 세포주기를 조절하는 가장 중요한 단백으로서,²⁾ Cyclin D1 유전자는 세포주기의 중요한 단계인 G1기의 진행에 작용하여 세포주기 조절과 성장인자에 대한 세포반응에 관여하는 신호변환 경로의 가교역할을 한다. 따라서 cyclin D1단백의 과발현은 세포가 G1기에서 머무르는 시간을 짧게하여 G1기에서 S기로의 이행을 촉진하는 역할을 한다.³⁾ 유세포계측기를 이용하여 세포의 DNA 함량측정, 종양세포의 DNA 배수성(ploidy)검색, 세포의 성장주기분석이 가능하여짐에 따라 여러 종류의 종양분석에 사용되고 있으며 핵산지수(DNA index；DI) 이외에 비배수성 clone의 수, 합성기 분획(S-phase fraction；SPF)이 고려되면 예후를 추정하는데 도움을 준다고 한다.⁴⁾
   이 연구의 목적은 후두의 편평세포암종에서 cyclin D1단백에 대한 단클론항체를 이용하여 면역조직화학적 염색을 시행하여 발현양상을 검토하고 유세포 계측검색으로 DNA 배수성, DNA 지수, S-phase 세포분획을 측정하여 상호 연관성을 검토하고, 임상적 특성과 비교 검토하여 후두 편평세포암종에서 종양의 생물학적 성상과 예후를 추정할 수 있는 인자로서의 유용성을 분석해보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   1994년 1월부터 1996년 12월까지 조선대학교병원 이비인후과에서 후두암으로 진단받고 치료받은 환자의 조직 표본중에서 충분한 종양 조직이 남아있는 28예의 병리조직을 이용하여 면역조직화학적 검색 및 유세포계측 검색을 하였다. 대상 환자들의 연령 및 성별 분포는 초진 당시의 나이를 기준으로 44세에서 75세까지였고, 여자는 2예로서 50세 이상의 남자가 대부분이었으며 평균 연령은 60.3세 이었다. 발생부위별로 보면 성문암이 18예(64.3%), 성문상부암이 10예(35.7%)였으며, 병리조직학적 분화도는 고분화암 13예(46.4%), 중등도분화암 13예(46.4%), 저분화암 2예(7.2%)였다. 미국 암협회 분류(AJC classification, 1997)에 따른 T-병기는 T2 5예(17.9%), T3 14예(50.0%), T4 9예(32.1%)였으며, 임상적 병기는 제2기 5예(17.9%), 제3기 11예(39.3%), 제4기 12예(42.8%)로서 대부분이 3, 4기의 진행된 암이었다.

방  법

   환자의 임상적 경과에 대해서는 진료기록을 후향적으로 검토하였고, 해부병리과 조직 슬라이드 파일을 대상으로 후두암을 조직학적 아형에 따라 구분하고, 이를 병록지에 의해 임상적 병기를 정하여 세분하였다.

면역조직화학적 염색

   일반 광학현미경 검경 후 선택된 파라핀 블록을 찾아서,이를 각각 4 μm두께로 연속 박절하여 silanized slide(DAKO Co., Denmark)에 부착시킨 후 탈파라핀과 함수과정을 거친후 DAKO사의 LSAB kit와 AEC kit를 이용하여 ABC법으로 염색을 시행하였다. 내인성 과산화효소의 활성을 억제하기 위하여 3% 과산화수소 용액에 10분간 반응시켜 phosphate-buffered saline(PBS, pH 7.4)에 3회 세척하였다. 1차와 2차항체에 대한 비특이적 결합을 방지하기 위해 차단항체에 10분간 처리한 후 PBS로 세척하고, 1차항체 cyclin D1은 쥐의 단클론 항체인 G124-326(Bio-Genex, USA)를 1：30으로 희석하여 실온에서 1시간 반응시켜 PBS로 3회 충분히 씻었다. Biotin과 결합된 2차항체를 가하고 10분간 반응시켜 PBS로 씻은 후 streptavidin-peroxidase와 반응시켜 PBS로 세척한 뒤 peroxidase의 기질액인 hydrogen peroxide와 발색제인 AEC(3-amino-9-ethylcarbazol)에 반응시켜 발색 시작 5분 경과시점으로부터 수시로 현미경을 통한 정색반응을 확인하여 발색을 마친후 Mayer’s hematoxylin으로 대조염색을 하여 universal crystal mount(Biomeda Co., USA)로 봉입하였다.

유세포 분석

   종양세포의 DNA 배수성 검사를 위하여 파라핀 포매 조직을 50 μm 두께로 2~3개씩 박절하여 시험관에 넣은 후 37°C 온수조에서 3 ml의 xylene에 40분간 두 번 탈파라핀 시키고, 농도 차등을 둔 100%, 95%, 70% 알코올 3 ml에 각기 실온에서 20분간 함수과정을 거친 후 50% 알코올 3 ml에 실온에서 밤새 처리하였다. 다음날 PBS에 실온에서 1시간씩 두 번 세척한 후 0.5% 펩신에 37°C 온수조에서 30분간 소화 시켰다. 원심분리(1,500 rpm, 10분)후 PBS로 10분씩 두 번 세척하고 완충액 (dimethylsulfoxide(DMSO) in sucrose sodium citrate buffer)으로 부유시킨 후 가위로 잘게 잘라 단일세포 부유액으로 만들었다. 60 μm 나이론메쉬에 여과시킨 후 cell counter chamber를 이용하여 210 6/ml정도의 세포를 취하여 PBS로 세척한 뒤 원심분리(1,500 rpm, 5분)하여 상층액을 버린 후 세포 침전물에 용액 A(trypsin in spermine tetrahydrochloride detergent buffer) 250 μl를 넣고 섞은 후 실온에서 10분간 반응시켰다. 여기에 용액 B(RNase A and trypsin inhibitor in spermine buffer) 200 μl를 넣고 섞은 후 실온에서 10분간 반응시켰다. 여기에 용액 C(propidium iodide in spermine buffer, CycleTEST^TM plus reagent kit, Becton Dickinson, USA) 200 μl를 넣고 섞은 후 4°C 암실에서 10분간 염색하였다. FACSCaliber(Becton-Dickinson, USA)을 이용하여 DNA 배수성 및 지수를 측정하였다.

면역조직화학적 염색의 판정

   염색 결과의 평가는 주관성을 어느 정도 배제하기 위해 해부병리 전문의의 도움으로 시행하였다. 종양세포의 핵내 염색이 10% 이상인 경우를 양성으로 판정하였으며 10~40%, 41~70%, 71%이상 염색된 경우를 각각 ＋, ＋＋, ＋＋＋로 구분 하였다.

통계학적 검증
   cyclin D1단백의 발현, DNA 배수성 및 SPF수치 등과 T-병기, 림프절 전이여부, 병리조직학적 분화도 그리고 임상적 병기 등과의 관련성에 대한 통계학적 검정은 Chi-square 검사와 Fishers exact 검사를 시행하였으며 유의 수준은 p<0.05로 정하였다.

결     과

Cyclin D1단백의 발현율
   Cyclin D1단백에 발현된 경우는 종양세포의 핵내에 적갈색 과립으로 염색되었다. 10%이상의 핵내 염색반응을 보인 경우는 17예(60.7%)였고 2＋ 이상의 강양성 발현은 7예(25%)였다(Fig. 1).

유세포 계측에 의한 배수성

   유세포 계측기를 이용한 배수성 검사에서 이배수성은 23예(82.1%), 비배수성은 5예(17.9%)였다(Fig. 2). 28예 전체의 SPF 범위는 0.0%에서 83.9%로서 평균은 41.4%(중앙값 35.2%) 였으며, 이배수성인 예의 평균은 34.2%(중앙값 26.6%), 비배수성 5예의 평균은 74.7%(중앙값 73.5%)로 비배수성인 예의 SPF가 현저히 높았다. 전체 SPF치의 중앙값인 35.2보다도 높은 SPF를 보인 경우는 비배수성은 5예(100%) 전예에서, 이배수성은 9예(39.1%)였다(Table 1).
   비배수성을 보인 5예의 DNA index는 각각 1.74, 1.18, 1.76, 1.66, 1.19 이었으며 SPF는 66.8%이상에서 83.9%이하로 이배수성에 비하여 훨씬 높은 수치를 보였고, 5예중에서 4예가 림프절 전이가 있는 예이었다(Table 2).
   이배수성인 예의 cyclin D1단백의 발현율은 52.2%, 비배수성인 예는 100% 로서 통계학적인 유의성이 있었다(p<0.05). SPF 35.2 이상인 예중 cyclin D1단백에 양성발현은 71.4%, SPF 35.2 미만인 예는 50%로서 차이를 보였으나 통계학적인 유의성은 없었다(Table 3).

DNA 배수성과 임상적 특성의 비교

   이배수성군은 경부림프절 전이가 없었던 예가 65.2%, 전이가 있었던 예가 34.8%였으나 비배수성군에서는 전이가 없었던 예가 20%, 전이가 있었던 예가 80%로서 비배수성군에서 림프절 전이가 있었던 예가 통계학적으로 유의하게 높았다(p<0.05). SPF가 35.2보다도 높은 예중 림프절 전이가 있었던 예가 66.7%, 전이가 없었던 예가 37.5%로서 SPF가 35.2미만인 군의 33.3%, 62.5%에 비하여 SPF가 높은 예에서 통계적 유의성이 있는 결과를 보였다(p<0.05). 그러나 T-병기, 임상적 병기, 조직학적 분화도와는 통계학적인 유의성이 없었다(Table 4).

면역조직화학적 발현양상과 임상적 특성의 비교

   림프절 전이가 있었던 예의 경우 cyclin D1 발현은 75%로서 림프절 전이가 없었던 경우의 50%에 비교하여 높은 발현율을 보였으나 통계학적인 유의성은 없었다. 또한 T-병기, 병리조직학적 분화도, 임상적 병기 등과도 통계학적인 유의성이 없었다(Table 5).

고     찰

   후두 편평세포암종은 주로 음주, 흡연, 바이러스 감염, 영양결핍, 식생활 습관 등이 주된 유발 요인으로 작용하여 암유전자의 활성화 혹은 종양억제 유전자의 비활성화에 의하여 유발되는 것으로 알려지고 있다.
   Cyclin D1은 염색체 11q13에 위치하는 유전자로 cyclin dependent kinase 4 혹은 cyclin dependent kinase 6과 결합하여 cyclin-CDK 복합체를 형성하고, 이 효소의 활성도를 조절하여 세포주기를 조절한다. 즉, G1기에서 S기로 이동하는 check point를 조절하는데 관여하는 G1 cyclin과 G2기에서 M기로 이동하는데 관여하는 M cyclin이라고 하며, G1 cyclin에는 D와 E가 포함되고 M cyclin에는 A와 B 등이 있다. 이중에서 cyclin D은 가장 중요한 조절인자로서 지금까지 알려진 것은 D1, D2, D3인데 이중 cyclin D1유전자 증폭은 암 발생 및 암의 악성도와 관계가 있는 암유전자로 인정되고 있다.⁵⁾
   두경부암에서 cyclin D1 유전자의 과발현에 대한 임상적 의의는 아직 명확히 규명되지는 않았으나 두경부, 폐, 식도의 편평세포암종 등 여러 암종의 10~50%에서 cyclin D1 유전자의 증폭이 있으며 임상 예후와 관계가 있다는 보고가 있다.⁶⁾ Michalides 등⁶⁾은 두경부암의 면역 조직화학적 연구에서 47예중 30예(64%)에서 cyclin D1의 과발현이 낮은 생존율과 관계가 있다고 하였으나, Davidson 등⁷⁾은 cyclin D1의 증폭이 22%에서 관찰 되었지만 임상병기나 병리학적 인자와는 관련이 없다고 하였다. 국내의 연구에 의하면 Kim 등⁸⁾은 두경부 편평세포암종 40예중 25%에서 cyclin D1에 양성 발현을 보고하였고, 37예를 대상으로한 연구⁹⁾에서는 32.4%가 발현하였고 이중 후두암은 34.8%의 발현율을 보였다고 하고, 임상적 병기, 림프절 전이, 병리조직학적 분화도 등과 발현율의 상관관계는 없다고 하였으나, 다른 연구¹⁰⁾에서는 후두암은 33%, 하인두암은 100%의 발현율이며 발현예에서 생존율이 나빴다고 하였다. Tae 등¹¹⁾은 두경부 편평세포암종 26예중 19%에서 cyclin D1의 유전자 증폭이 있었다고 하였고, So 등¹²⁾은 cyclin D1이 후두암 30%, 하인두암 60%의 발현율을 나타내었으나 임상적인자와는 관련이 없다고 하였다.
   이 연구에서 cyclin D1단백에 대한 전체 양성 발현율은 17예(60.7%)로서 Michalides 등⁶⁾의 연구와는 유사하였으나, 다른 연구자들 보다도 높은 양성 발현율을 보였다. 림프절 전이, 병리학적 분화도와 임상적 병기에서도 유의한 상관관계를 볼 수 없었다. 이는 cyclin D1 유전자의 증폭이외에도 촉진자 부위에서의 돌연변이, 조절인자의 변형, 유전자 전위, 역위 등에 의하여 단백질 과발현이 발생할 수 있기 때문으로 생각한다.
   핵단백의 합성이 세포주기안에서 분명히 구분되는 간격을 갖는다는 cell kinetics에 관한 개념이 도입된 이래로 세포주기를 반영하는 여러 인자들에 관한 연구가 있었다. 세포주기를 관찰하는 유세포 분석기에 의한 연구가 과거에는 신선한 조직만이 이용 가능하여 연구에 제약이 많았으나 최근에는 분자생물학적 기법이 발달되어 파라핀 포매조직에서도 염색이 가능하게 되어 종양세포의 증식능을 간편하고 신속하게 측정할 수 있게 되었다.¹³⁾
   두경부종양에서 DNA 배수성과 예후를 연구한 결과는 연구자에 따라 매우 다양한 결과를 보고하고 있다. Guo 등¹⁴⁾은 두경부종양에서 36%가 이배수성을 보이고 64%는 비배수성이고, 구강, 인두, 후두종양에서 이배수성 종양이 생존에 유리하다고 하였고, Holm 등¹⁵⁾도 두경부암에서 75%가 비배수성이라고 했다. 또한 Kim 등¹⁶⁾은 후두암 29예중 이배수성이 10예, 비배수성이 19예라고 하였다. Guzman 등¹⁷⁾과 Yasuda 등³⁾도 후두암에서 종양의 배수성과 환자의 생존, 재발, 조직병리학적인 변화와는 관계가 없다고 하였고, Ross 등¹⁸⁾은 DNA 배수성의 예후인자로서 가치는 다른 고형종양에서는 잘 알려져 있지만, 후두암에서는 그 역할이 불확실하다고 하였고, Holm 등¹⁵⁾은 두경부종양에서 DNA양이 많은 종양은 DNA양이 적은 종양보다 진행된 임상적병기를 갖으며 예후가 더 나쁘다고 했고, DNA양이 배수성의 type보다 예후인자로서 가치가 더 크다고 주장하였다. 본 연구에서는 후두암종의 배수성 검사에서는 23예(82.1%)가 이배수성이었고 5예(17.9%)만이 비배수성으로 타보고자 보다 낮은 결과를 보였다. 배수성과 임상적 특징의 비교에서 림프절 전이여부와 배수성 사이에는 유의한 차이가 있었으나 그외의 인자와는 관련이 없었다.
   세포의 성장주기중 G0/G1과 G2/M peak 사이의 세포를 S기세포라 하는데 SPF와 DNA 배수성, DNA양 및 예후를 보면 Kreicbergs 등¹⁹⁾은 연부조직종양에서 대부분의 비배수성종양은 SPF 비율이 높고 반면에 이배수성 종양은 낮다고 했으며 이배수성 종양이 비배수성 종양보다 예후가 좋다고 했다. Kim 등¹⁶⁾도 DNA의 배수성과 양, SPF, 림프절전이, 임상경과는 상관관계가 없었다고 했다.
   이 연구에서는 SPF는 비배수성의 경우 평균이 74.7%였으며 이배수성은 34.2%로 비배수성인 예의 평균이 훨씬 높게 나타났다. SPF와 임상적 경과의 비교에서는 SPF가 중앙값보다도 높았던 군이 림프절 전이와 상관관계가 있어 예후추정상 하나의 위험인자로 작용한다고 추정 할 수 있었다. DNA의 배수성과 SPF에 따른 cyclin D1단백의 발현율을 비교한 결과는 이배수성인 경우 발현율은 52.2%였고, 비배수성인 경우는 100%의 발현율로서 유의하게 비배수성의 발현율이 높았다. 또한 SPF가 중앙값 이상인 예에서 발현율이 71.4% 로서 통계학적인 유의성은 없었으나 발현율이 높게 나타난 결과를 보였다.
   따라서 비배수성과 SPF치가 높은 경우는 림프절 전이와 연관성이 있고, cyclin D1단백의 양성 발현율이 높았다. 그러나 본 연구결과 나타난 cyclin D1단백의 면역조직화학적 발현의 의의 및 cyclin D1단백과 유세포 계측결과, 특히 SPF와의 결과 해석을 단순하게 cyclin D1단백 그리고 세포주기 상호간의 관계를 산술적으로 계산되는 공식적인 관계로 해석하는데는 여러 가지 문제점이 있다고 생각된다. 그러므로 종양형성 과정상의 관련인자로서 또는 종양의 예후인자로서의 이들의 의의는 상호 연관관계를 고려하지 않는 것이 타당하다고 생각되었다.

결     론

   후두 편평세포암종을 대상으로 cyclin D1 단백의 발현양상을 관찰하고, 유세포 계측기를 이용하여 DNA 배수성, S-phase 세포분획을 측정하여 비교 검토한 결과 cyclin D1단백의 발현은 후두편평세포암의 발생에 관여하는 것으로 생각되나 임상적 예후인자와의 연관은 없었다. 비배수성과 SPF치가 높은 경우는 림프절 전이와 연관성이 있고, cyclin D1단백의 양성 발현율이 높았다. 그러나 종양의 예후 추정인자로서 이들의 상호 연관관계는 의미가 없다고 생각된다.

1. Horiuchi M. Clinicopathological prognostic factors of squamous cell carcinoma of the head and neck. Cancer and Chemotherphy 1996;23:257-64.

2. Lane DP, Benchimol S. P53 oncogene or anti-oncogene? Genes Dev 1990;4:1-8.

3. Yasuda N, Omori A, Goto T, Hisa Y. Prognostic significance of DNA ploidy of ealry glottic cancer. Nippon Jibiinkoka-Gakkai-Kaiho 1990;93:1171-8.

4. Kallioniemi OP, Punnonen R, Mattila J, Lehtinen M, Koivula T. Prognostic significance of DNA index, multiploidy, and S-phase fraction in ovarian cancer. Cancer 1988;61:334-9.0.

5. Berenson JR, Koga H, Yang J, Pearl J, Holmes EC, Figlin R. Frequent amplification of the bcl-1 locus in poorly differentiated squamous cell carcinoma of the lung. Oncogene 1990;5:1343-8.

6. Michalides R, Veelen NJ, Kristel PP. Overexpression of cyclin D1 indicates a poor prognosis in squamous cell carcinoma of head and neck. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1997;123:497-502.

7. Davidson BJ, Abate MP, Chaganti RSK, Schwatz SP. Cycin D1 amplification, risk factor and clinicopathologic presentation in head and neck Cancer. Otolarygol Head Neck Surg 1993;109:248(abstract).

8. Kim SH, Chung DH. Expression of cyclin D1 protein in head and neck squamous cell carcinomas. Korean J Otolaryngol 1996;39:993-9.

9. Kim SH, Park SA, Oh YS. Expression of p16 protein and cyclin D1 protein in head and neck squamous cell carcinomas. Korean J Otolaryngol 1998;41:901-5.

10. Kim SH, Yeom BW. Amplification and overexpression of cyclin D1 in head and neck squamous cell carcinomas. Korean J Otolaryngol 1997;40:1801-7.

11. Tae K, Lee HS, Park CW, Ahn KS, Cho YH, Kong K. Amplification of cyclin D1 in head and neck squamous cell carcinomas. Korean J Otolaryngol 1997;40:1128-32.

12. So SH, Song BC, Jung YG, Rho YS, Lim HJ, Kim DH. Prognostic significance of Ki-67 index and expression of cyclin D1 in squamous cell carcinoma of the larynx and hypopharynx. Korean J Otolaryngol 1999;42:603-9.

13. Hedley DW, Friedlander ML, Tayler IW, Rugg CA, Musgrove EA. Method for analysis of cellular DNA content of paraffin-embedded pathological material using flow cytometry. J Histochem Cytochem 1983;31:1333-5.

14. Guo YC, Desanto L, Osetinsky GV. Prognostic implications of nuclear DNA content in head and neck cancer. Otolaryngol Head Neck Surg 1989;100:95-8.

15. Holm LE, Jacobsson P, Killander D, Silfversward C. DNA and its synthesis in individual tumor cells from human upper respiratory tract squamous cell carcinomas. Laryngoscope 1980;90:1209-24.

16. Kim KH, Sung MH, Chung JW, Chung PS, Park SH. Flow cytometric analysis of DNA count in laryngeal cancer. Korean J Otolaryngol 1992;35:783-93.

17. Guzman RB, Martorell MA, Basterra J, Armengot M. Analysis of DNA content in supraglottic epidermoid carcinoma. Otolaryngol Head Neck Surg 1993;109:706-10.

18. Ross DW. Clinical usefulness of DNA-ploidy and cell cycle studies. Arch Pathol Lab Med 1993;117:1077-82.

19. Kreicbergs A, Tribukait B, Willems J. DNA flow analysis of soft tissue tumors. Cancer 1987;59:128-33.