교신저자：박성국, 614-735 부산광역시 부산진구 개금동2동 인제대학교 의과대학 부산백병원 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   비용은 부종성 점막의 종양으로 이비인후과 영역에서 흔히 볼 수 있으며 치료로는 수술과 약물요법이 있다. 비용의 내과적인 치료인 약물요법은 스테로이드 제재의 약물을 비강내 분무하거나 전신투여의 방법이 이용된다.
   국소 및 전신 투여한 스테로이드는 비폐색 증상을 감소시키며, 비용의 크기를 감소시킬 뿐 아니라 수술 후 재발을 방지하는 것으로 알려져 있으며 손상된 상처의 회복과정에서 혈관재생을 억제하는 것으로 알려져 있다.¹⁾ 이들 약물은 세포막을 통과하여 세포질 내에 있는 수용체와 결합함으로써 활성화되고 이러한 결합체가 핵 내로 들어가 염증과 관계된 유전자와 결합하여 유전자의 발현을 조절하고 염증과 관계된 유전자 발현을 유도하는 activator protein-1(AP-1) 전사인자나 nuclear factor-kappa B(NF-κB) 전사인자와 결합하여 이러한 전사인자의 작용을 억제한다.²⁾
   국소 스테로이드는 알레르기성 비염의 비점막에서 증가되어 있는 항원제시 랑게르한스 세포를 정상화시키고 비용에서 CD3^＋, CD4^＋, CD8^＋등 T림프구의 수를 감소시키며 호산구의 전체 수를 감소시키고 활성화된 세포의 수도 감소시킨다. 또한 비용에서 국소 스테로이드 치료 후 비 분비물에서 알부민 치가 떨어져 있는 것은 항 삼출 효과가 있는 것을 보여준다.³⁾ 국소 스테로이드에 반응하지 않는 경우는 낭성 섬유증, 원발성 섬모운동 이상증, 호산구가 아닌 호중구의 국소 침윤을 특징으로 하는 질환과 화농성 염증 또는 비폐색 환자들의 분무 스테로이드의 부적절한 사용 등이다.³⁾ 또한 발달 중인 비용에서 잘 보이는 증식중이고 미분화된 세포들은 스테로이드에 반응이 약하다.⁴⁾
   비용에서 스테로이드의 전신적 투여의 효과는 일반적으로 인정되나 연구된 것은 적다. 이에 저자들은 수술전 스테로이드를 사용한 비용과 사용하지 않은 비용조직에서 비용의 형성과 성장에 관련이 있는 Tumor necrosis factor-α(TNF-α), Transforming growth factor-β1(TGF-β1), Platelet-derived endothelial cell growth factor(PD-ECGF)의 발현을 비교하여 이들 인자들에 대한 경구용 스테로이드의 효과를 알아보고자 본 연구를 시행하였다.

재료 및 방법

재  료
   비용을 동반한 만성 부비동염 환자 중 비알레르기 증상이 없고 MAST CLA allergy system(MAST immunosystem, CA, USA)상 음성, 천식 및 피부알레르기의 과거력이 없는 환자 23명의 비용조직을 대상으로 하였다.
   비강내 비용을 채취하여 일부는 즉시 eppendorf tube에 분리하여 넣은 후 액화질소용기에서 냉동시켜 곧바로 -70°C에서 냉동 보관하였으며, 일부는 면역조직화학적 검사를 위해 포르말린에 고정한 후 파라핀 블록을 만들었다. 비용을 동반한 만성 부비동염 환자 중 수술전 적어도 4주간 국소 또는 경구용 스테로이드를 사용하지 않은 10예를 제 1 군, 수술전 경구 스테로이드제인 프레드니솔론을 하루 30 mg씩 1주간 투여한 13예를 제 2 군으로 나누었다. 연령분포는 제 1 군의 경우 14~76세로 평균 41세 였고 남자 7예 여자 3예 였으며, 제 2 군은 14~45세로 평균 28.9세 였고 남자 6 예 여자 7예 였다.

방  법

역전사 중합효소 연쇄반응

Total RNA 추출 및 first strand cDNA 합성
   RNA를 추출하기 위하여 Qiagen사의 RNeasy kit를 사용하였다. 1% mercaptoethanol이 첨가된 lysis buffer 1 ml을 첨가한 후 각각의 조직을 100 mg 정도 넣고 조직파쇄기(Biospec product, WI, USA)와 QIAshredder 칼럼(Qiagen, Germany)을 이용하여 조직을 균질화하였다. 70% 에탄올을 첨가하여 RNeasy 칼럼에 loading하고 wash buffer로 3회 세척한 후 3차 증류수 50 μl로 RNA를 용출하였다. 용출된 RNA는 흡광광도계로 측정하여 농도를 측정하였다. 2 μg의 total RNA에 oligo(dT)_15-18 2 μg을 넣고 70°C에서 10분간 전 처리한 후 1 mM dNTP(Takara, Japan), 200 unit Moloney murine leukemia virus(MMLV) 역전사효소(Promega, WI, USA)와 5× 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT)을 최종 25 μl가 되게 넣고 42°C에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 역전사효소의 활성을 제거하기 위해 95°C에서 5분간 불활성화시켜 cDNA를 합성하는 역전사 반응을 시행하였다.

중합효소 연쇄반응
   cDNA을 이용하여 PD-ECGF, TNF-α와 TGF-β1 유전자의 발현을 확인하기 위하여 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 중합효소 연쇄반응은 2 μl의 cDNA와 PD-ECGF, TNF-α, TGF-β1와 β-actin 각각의 20 pmol의 sense와 antisense primer(Table 1), 증류수를 Premix PCR kit(Bioneer, Korea)에 혼합하여 중합효소 연쇄반응에 사용하였다. 중합효소 연쇄반응은 Gene Amp PCR system 2400(Perkin-Elmer)에서 94°C에서 5분간 변성시킨 후 94°C에서 20초, 62°C(β-actin) 또는 60°C(angiogenesis factors)에서 20초 그리고 72°C에서 1분의 주기로 약 35회 증폭한 후 72°C에서 7분간 반응을 연장시켰다. 음성 대조군으로 cDNA대신 증류수와 반응액을 혼합한 것을 사용하였다. 최종 중합효소 연쇄반응 산물을 2% agarose gel에서 전기영동을 한 후 ethidium bromide로 30분간 염색하여 확인하였다. 총 RNA의 파괴여부 및 상대적 정량비를 구하기 위하여 대조군으로 β-actin을 사용하여 각각의 중합효소반응 띠의 밝기를 농도 분석기(MyImager 100, Seoulin Bioscience, Korea)를 사용하여 비교하였다.

면역조직화학적 검사
   수술로 얻은 비용 조직을 3% 중성 포르말린에 하루동안 고정하고 일반적인 방법에 따라 파라핀 블록을 제조하였다. 비용 조직은 파라핀 블록에서 4 μm 두께의 절편을 박절하여 유리 슬라이드에 부착시켰으며 비용 조직이 부착된 슬라이드는 60°C에서 1시간, 100% xylene에서 10분간 2회 탈 파라핀 과정을 거친 후 슬라이드는 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 50% 계열 알코올로 함수과정을 거친 후 증류수로 세척하였다. 내인성 peroxidase을 억제하기 위하여 메탄올과 30% 과산화수소수가 9：1의 비율로 섞인 용액에 10분간 처리하여 Tris buffered saline(TBS, pH 7.4)로 3회 수세하였다. 슬라이드는 항원성 회복을 위하여 1% zinc sulfate(Sigma Chemical Co., MO, USA)가 포함된 10 mM citrate buffer(pH 6.0)에 넣고 microwave 오븐을 이용하여 5분간 3번 가열하였으며 슬라이드는 항체에 대한 비 특이적 반응을 억제하기 위하여 0.5% 염소혈청 혹은 0.5% 토끼혈청(Dako, CA, USA)을 함유한 TBS용액에 30분간 실온에서 처리하였다. 슬라이드로부터 혈청을 제거한 후 일차항체를 첨가하여 4°C에서 하루동안 반응시켰다. 본 연구에 사용한 일차항체의 종류와 희석농도는 Table 2와 같다(Table 2).
   일차항체의 처리가 끝난 슬라이드는 0.1% Tween 20 (Bio-Rad, CA, USA)이 포함된 TBS로 10분간 3차례 수세하였으며 일차항체가 PD-ECGF로 처리된 슬라이드는 이차항체로 biotinylaed goat anti-rabbit IgG(Dako, CA, USA)과 사용하였으나, 그 외 본 실험에서 사용한 나머지 일차항체로 처리된 슬라이드는 이차항체로 biotinylaed goat anti-mouse IgG(Dako, CA, USA)을 이용하여 실온에서 30분간 반응시켰다. TBS로 3차례 수세한 후 슬라이드는 horseradish peroxidase(HRP)-conjugated streptavidin(Dako, CA, USA)과 실온에서 30분간 결합시킨 후 TBS로 3차례 수세하였다. 발색은 0.05% 3, 3-amino-9-ethyl carbamazole(AEC, Sigma Chemical Co., MO, USA)/0.01% H2O2가 함유된 TBS로 실온에서 10분간 반응시켰으며 음성대조는 일차항체 대신 TBS를 사용하여 위와 동일한 과정에 의해 염색하였다. 대조염색은 Mayer's hematoxylin을 이용하였으며 염색결과의 분석은 두 명의 병리의사가 독립적으로 광학 현미경으로 관찰하여 판정하였다. 스테로이드를 투여하지 않은 비용조직과 투여한 비용조직을 상피세포, 기저막, 염증세포, 혈관내피세포로 각각 분류하여 판독하였고, 각 세포에서 발현되는 정도는 전혀 발현되지 않는 경우를 0점, 전체세포 중 5% 미만으로 발현되는 경우를 1점, 5~30% 발현되는 경우를 2점, 30~50% 발현되는 경우를 3점, 50% 이상 발현되는 경우를 4점으로 표기 분류하였다.

통계학적 처리
   통계학적 검증은 SAS(release 6.12) 통계 패키지를 이용하여 Wilcoxon rank sum test와 Fisher's exact test를 실시하였으며 통계학적인 유의성은 p값이 0.05미만인 경우로 하였다.

결     과

역전사중합효소 연쇄반응
   실험에 사용한 각각의 조직에서 분리한 total RNA의 통합성과 적절한 cDNA 합성 여부를 확인하기 위하여 β-actin 발현을 확인하였다. 모든 조직에서 예상하였던 544 bp 크기의 증폭 산물을 확인할 수 있었으며 TGF-β1, TNF-α 그리고 PD-ECGF 유전자에 대한 RT-PCR 결과 각각에서 예상하였던 337 bp, 325 bp 그리고 561 bp의 크기와(Table 1) 동일한 산물들을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
   경구 스테로이드를 사용하지 않은 비용조직 10례중에서 TGF-β1 mRNA는 10예, TNF-α는 7예, PD-ECGF는 7 예가 발현되었으며 경구 스테로이드를 투여한 환자의 비용조직 13예중에서 TGF-β1 mRNA는 10예, TNF-α는 2 예, PD-ECGF는 1예가 발현되어 경구 스테로이드를 투여한 비용조직에서 TNF-α와 PD-ECGF는 경구 스테로이드를 투여하지 않은 비용조직보다 의미있게 발현이 감소하였으며 TGF-β1은 발현이 감소하였으나 통계적 의의는 없었다(Fig. 1, Table 3).

면역조직화학검사
   스테로이드를 사용하지 않은 비용조직에서 TNF-α와 PD-ECGF는 상피세포, 염증세포, 내피세포에서 대부분 발현되었으며 TGF-β1은 상피세포와 염증세포에서 대부분 발현되었다. 발현정도를 점수로 계산하여 비교해본 결과 평균은 경구 스테로이드를 투여하지 않은 비용조직에서 TGF-β1은 1.60±0.97, TNF-α는 2.56±0.76, PD-ECGF는 2.40±0.68 였으며 경구 스테로이드를 투여한 비용조직에서 TGF-β1은 0.97±0.83, TNF-α는 0.90±0.57, PD-ECGF는 1.13±1.03로 경구 스테로이드를 사용한 비용조직이 사용하지 않은 비용조직보다 TNF-α와 PD-ECGF는 의미있게 낮은 발현을 보였으며(Figs. 2 and 3) TGF-β1은 발현이 낮았으나 통계적 의의는 없었다(Fig. 4).

고     찰

   비용은 부종성 점막의 종양으로 상측벽의 중·상비도 근처 특히 사골동 점막에서 호발하며 치료로는 수술적 치료와 약물치료가 있으나 술 후 재발이 빈번하다. 비용에서 내과적 치료의 목적은 비용과 비염 증상을 제거하고 비 호흡과 후각의 회복 및 비용의 재발을 방지하는 것이다. 스테로이드는 비용의 치료에 효과가 있다고 알려진 약물로 수술적 치료와 거의 같은 결과를 얻을 수 있다는 보고도 있다.⁵⁾ 스테로이드의 국소적 투여는 비염 증상의 완화, 비호흡의 개선, 비용의 크기를 감소시키고, 재발율을 감소 시키나 후각과 부비동의 병변에 대한 효과는 거의 없다. 스테로이드의 전신적투여에 대한 연구는 적으나 증상과 후각을 포함하는 병변에 효과가 있다고 알려져 있으며 부작용 때문에 단기간 사용해야 된다는 단점이 있다.³⁾ 스테로이드의 작용은 수용체와의 반응으로 시작되며 스테로이드가 세포막을 투과해 세포질 내에 있는 수용체와 결합하여 수용체를 활성화시키고 활성화된 스테로이드-수용체 결합체가 핵 내로 들어가 염증과 관계된 여러 가지 유전자의 발현을 조절한다.²⁾ 스테로이드 수용체(Glucocorticoid receptor)는 α와 β isoform이 있으며 스테로이드 수용체의 발현정도는 조직과 세포마다 차이가 있고 같은 조직이라도 개체간에 차이가 있는 것으로 알려져 있다.⁶⁾ 스테로이드에 대한 반응성은 염증환경 내에서 여러 가지 요소에 의해 결정되며 스테로이드 수용체의 농도 및 결합력 뿐만 아니라 스테로이드 수용체와 스테로이드가 결합한 이후에 스테로이드 수용체가 GREs(glucocorticoid response elements)나 AP-1 및 NF-kB와 같은 전사인자와의 상호작용에 의해서도 결정된다.⁷⁾ Kang 등⁸⁾은 비용에서 스테로이드 수용체 및 스테로이드 수용체 β isoform은 상피세포 및 점막하 염증세포에 주로 발현되고 혈관내피세포와 일부 점막하샘 주위세포에도 발현이 관찰되며 스테로이드 수용체 β isoform은 스테로이드 수용체와 유사한 발현정도 및 분포를 보인다고 하였다. 상피세포가 국소스테로이드의 첫 작용세포이고 상피세포내에 스테로이드 수용체의 발현이 강하게 나타나며 스테로이드가 상피세포의 염증매개물질 합성을 억제하기 때문에 상피세포가 국소스테로이드의 중요한 작용 부위라고 할 수 있다.⁹⁾
   또한 혈관내피세포는 지질매개물을 분비하고 접착분자의 발현을 조절하며 혈장 삼출의 조절에 중요한 기능을 하는데 스테로이드가 이러한 기능을 억제하기 때문에 염증세포와 함께 스테로이드의 중요한 작용세포라고 할 수 있다.¹⁰⁾ 스테로이드는 비용에서 상피세포 증식과 분화를 방해함으로써 결체조직 재건에 영향을 주어 비용에서 특징인 부종과 지나친 상피 성장을 억제한다. 경구용 스테로이드는 비용조직에서 호산구의 숫자를 감소시키며 접착 분자의 세포내 발현을 감소시키고 eotaxin 양을 억제 한다.¹¹⁾ Van Camp와 Clement¹²⁾는 경구용 Glucocorticoid로 비용을 치료시 모든 증상에 효과가 있으나 5개월 후에 재발하며 경구용 Glucocorticoid는 현저한 항 염증 효과를 가지고 있어 천식 같은 호산구와 연관된 염증성 질환의 치료에 효과가 있다고 하였으며, Park 등¹⁾은 토끼의 상악동 점막에 기계적 손상만으로 비용의 발생을 유도한 후 스테로이드를 국소 투여한 결과 시간이 경과 할수록 비용의 크기가 감소하며 비용 변연부에서 신생혈관의 발달을 억제한다고 하였다. 또한 변연부의 신생혈관의 억제가 미세강 형성과 융합을 억제하고 비용의 변연부에서의 분리를 방해하여 완전한 비용 형성을 억제하는 것으로 생각된다고 하였다. Shin 등¹³⁾은 수술전 프레드니솔론을 사용한 비용종에서 CD4＋세포가 감소하여 비용종의 치료에 사용되는 경구용 스테로이드는 CD4＋세포를 감소시킴으로서 치료효과를 보인다고 하였으며, Rudack 등¹⁴⁾은 비용에서 프레드니솔론 치료 후 GM-CSF와 IL-5 단백질 양은 감소시키는 반면 IL-3 합성은 감소시키지 않았고 호산구의 생존은 프레드니솔론의 직접적인 효과 보다 사이토카인 생산의 방해에 의한 것으로 보인다고 하였다. 또한 IL-3 합성이 감소하지 않는 것은 스테로이드에 반응하지 않는 세포들에 의해 IL-3이 생산되기 때문이라고 하였으며 비용에서 스테로이드의 효과는 호산구와 연관된 사이토카인 뿐만 아니라 세포외 기질 단백질과의 상호작용과 연관이 있다고 하였다. TGF-β는 상피세포의 증식을 조절하고 세포외 기질형성을 촉진시키며 혈관형성을 유발하는 것으로 알려져 있다. 호산구에서 생성된 TGF는 비용의 병리적 변화에 기여하는데 기저막의 비후와 기질의 섬유화, 혈관의 형성, 상피분비선의 과형성 등의 작용을 한다. 이러한 TGF-β 유전자군 중에서 가장 잘 알려진 것이 TGF-β1 으로 이것이 과다 생성되면 세포외 기질이 병적으로 축적되고 조직의 섬유화가 심해지게 된다.¹⁵⁾
   그러나 TGF-β1은 림프구, 대식세포, 중성구, 비만세포 등에 작용하여 광범위한 염증 억제작용을 하는 것으로 알려져 있어 비용의 병태생리에서 호산구 침윤과 관계된 염증반응을 억제하는 면도 가지고 있을 것으로 생각할 수 있다. Bachert 등¹¹⁾은 경구용 corticoid를 사용한 환자의 비용에서 Eosinophil cationic protain(ECP)와 알부민이 스테로이드를 투약하지 않은 비용조직과 비교시 의미있게 감소하였으나 TGF-β1을 포함한 Eotaxin, fibronectin, hyaluronic acid, leukotrienes C4/E4/D4에는 차이가 없다고 하였으며, 경구용 corticoid 치료는 호산구성 염증의 하향조절과 비용에서 알부민의 축적과 혈관외 유출의 감소로 인해 비용의 수축을 유도 할 것이라 하였다. 저자들의 경우 스테로이드를 전신적 투여한 비용조직에서 TGF-β1 mRNA발현과 면역조직화학 염색상 발현이 스테로이드를 투여하지 않은 비용조직보다 의미있게 감소하지 않았다. 따라서 TGF-β1은 염증반응을 억제하는 면도 가지고 있어 경구용 스테로이드는 TGF-β1을 억제하지 않는 것으로 생각된다.
   TNF-α는 주로 활성형 임파구와 대식세포에서 생성되며 그외 중성구, NK세포, LAK세포, 성상세포, 내피세포, 평활근 등에서 생성된다. TNF-α는 광범위한 전구염증 효과를 가진 다기능 사이토카인으로 대부분의 기질세포를 자극해 다양한 사이토카인을 유리시키고 과립 백혈구의 혈관으로의 유착과 세포내로의 유주를 증진시키며 호산구 세포독성기능을 증진시키고 비용의 표피에 손상을 주는 것으로 여겨진다.⁴⁾ Lennard 등¹⁷⁾은 만성 부비동염에서 전신적 스테로이드 치료시 치료전과 비교하여 비점막에서 IL-6와 TNF-α 농도는 의미있게 감소하는 경향을 보였으며, IL-1과 IL-8은 감소하였으나 통계적으로 의의는 없다고 하였으나, Henriksson 등⁴⁾은 국소 budesonide로 치료한 비용조직이 치료하지 않은 비용조직에 비해 스테로이드 수용체 mRNA, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α, interferon α 모두 하향조절 되지 않아 국소 corticosteroid 치료에 의해 비용에서 스테로이드 수용체의 mRNA 혹은 사이토카인 하향조절은 일어나지 않는다고 하였으며 국소적 치료에 대한 상대적 내성은 적어도 표적세포로의 점막을 통한 활성물질의 불충분한 침투로 설명된다고 하였다. 저자들의 연구에서는 스테로이드를 전신적으로 투여한 비용조직에서 TNF-α mRNA 발현이 스테로이드를 투여하지 않은 비용조직보다 발현이 의미있게 감소하였으며 면역조직화학염색상 발현이 의미있게 감소하였다. 이것으로 보아 경구용 스테로이드는 TNF-α을 억제한다고 생각된다. Henriksson 등과 다른 결과는 국소 스테로이드와 경구용 스테로이드의 침투의 차이라 생각된다.
   PD-ECGF는 생체외에서는 내피세포의 화학주성을 자극하고 생체내에서는 맥관형성에 관여하며 맥관형성 부위에 축적되는 것으로 알려져 있는 비반세포의 화학역동현상과 이주를 증진시킨다.¹⁸⁾ PD-ECGF 발현은 저산소증뿐만 아니라 산성조건의 표지이며 저산소증은 생체내와 생체외에서 PD-ECGF 단백질의 발현을 상향 조절한다.¹⁹⁾ 비용에서 PD-ECGF에 대한 스테로이드의 효과에 관한 연구가 없어 비교할 수는 없으나 저자들의 경우 스테로이드를 전신적으로 투여한 비용조직에서 PD-ECGF mRNA 발현이 스테로이드를 투약하지 않은 비용조직보다 발현이 의미있게 감소하였으며 면역조직화학염색상에서도 발현이 의미있게 감소하였다. 이것으로 보아 경구용 스테로이드는 PD-ECGF를 억제한다고 생각된다.

결     론

   경구용 스테로이드는 비용의 형성과 성장에 관련이 있는 TNF-α, TGF-β1, PD-ECGF 중 TNF-α와 PD-ECGF 는 감소시켰으나 TGF-β1은 감소시키지 못하였다. 이것으로 보아 비용의 치료에 사용되는 경구용 스테로이드에 의한 TNF-α와 PD-ECGF의 감소가 치료효과의 한 기전으로 생각된다.

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