교신저자：정광윤, 136-705 서울 성북구 안암동 5가 126-1  고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   두경부 편평세포암종에서 경부 림프절 전이 여부는 가장 중요한 예후 인자로 알려져 있다.¹⁾²⁾ 모든 두경부 원발부위를 고려할 때 동측의 단일 림프절 전이는 생존율을 약 50% 감소시키고, 반대측이나 양측의 림프절 전이는 추가로 50% 정도의 생존율 감소를 가져온다.²⁾³⁾⁴⁾ 결과적으로 림프절 전이 상태가 치료방법의 결정과 예후 판단에 중요한 의의을 가지며, 이 때문에 컴퓨터단층촬영이나 자기공명영상, 초음파 등을 이용하여 진단 시에 경부 림프절 전이의 발견율을 높이려는 여러가지 시도가 있어 왔다.⁵⁾⁶⁾⁷⁾ 그러나 발달된 영상진단법에도 불구하고 임상적, 방사선학적 잠재성 전이의 비율은 여전히 높다.
   유방암이나 자궁내막암, 대장암에서 림프절 전이에 대한 연구에 의하면 면역조직화학적 검색이 기존의 hematoxylin-eosin 염색보다 잠재성 미세전이의 발견에 더 효과적임을 보고하고 있다.^8)9)10) 이에 저자들은 본원에서 시행한 경부 청소술 표본을 대상으로 후향적 연구를 통하여 통상적인 hematoxylin-eosin 염색에서 발견되지 않은 미세전이의 빈도와 특징을 cytokeratin에 대한 면역조직화학적 염색법을 통하여 밝히고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   1998년 1월부터 2001년 7월까지 고려대학교 안암병원 이비인후-두경부외과에서 두경부 편평세포암종으로 진단된 후 경부청소술을 시행받은 69예(80 표본)를 대상으로 하였다. 원발병소는 구강 23예, 구인두 8예, 하인두 11예, 후두 20예, 경부 식도 3예, 상악동 1예, 원인불명 전이암 3예였다.
   성별은 남자 57예, 여자 12예이었고, 수술당시 연령분포는 32세에서 75세로 평균 58.5세이었다. 원발부위와 경부 림프절의 병기는 미국 암 합동위원회(American Joint Committee on Cancer(1997))의 분류에 따라 재분류하였으며, 원발병소의 병기는 T1 8예, T2 14예, T3 30예, T4 14예이었다. 경부병기는 N0 11예, N1 18예, N2a 5예, N2b 24예, N2c 4예, N3 7예이었다(Table 1). 검사한 림프절의 개수는 총 1867개중 병리검사상 음성으로 진단된 1710개(mean per patient：24.8±7.4, mean per specimen：21.4±7.2, range 1 to 66)를 대상으로 하였다. 분화도에 따른 분포는 고분화형(well differentiated type)이 15예, 중등도 분화형(moderately differentiated type)이 40예, 저분화형(poorly differentiated type)이 7예, 미분화형(undifferentiated type)이 7예이었다.

면역조직화학적 염색
   면역조직화학적 염색을 위해 통상적인 포르말린 고정과 파라핀 포매를 거친 조직을 4 μm 두께로 박절하여 양전하를 띤 슬라이드(ProbeOn Microscope Slides, Fisher-Biotech, USA)에 부착시키고 60°C의 항온기에서 한시간 가온한 뒤 xylene으로 5분간 탈 파라핀을 3회 반복 시행한 후 순차적으로 낮은 농도의 알코올로 함수시킨 후 증류수로 수세하였다. 내인성 과산화효소의 활성을 억제시키기 위해 3% 과산화수소수를 사용하여 10분간 처리한 후 Tris 완충 용액(Tris 3.025 g, 1 M NaCl 40 g, 1 M HCl 22 ml in H₂O 5l, pH 7.4)에 씻었다. 항원 회복을 위해 citrate 완충 용액(sodium citrate 14.7 g, 1 M HCl 27 ml in H₂O 5l, pH 6.0)을 압력솥에 채우고 가온하여 끓기 시작할 때 슬라이드를 넣고 압력이 최고(103 kPa)에 도달한 후 2분간 더 끓이고 찬물에 담가 압력을 낮춘 후 슬라이드를 꺼내 Tris 완충 용액에 담갔다. 일차항체는 cytokeratin에 대한 monoclonal antibody로 AE1/AE3(Zymed, USA)를 Tris 완충 용액에 1：50으로 희석하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 일차항체 반응후 Tris 완충 용액으로 수세하고 이차항체인 biotinylated link anti-mouse and anti-rabbit immunoglobulin과 Horseradish peroxidase(HRP)에 streptavidin을 결합한 streptavidin-HRP를 이용하여 차례로 실온에서 30분간 반응시켰다. Tris 완충 용액으로 수세하고 발색제인 H₂O₂-3,3'-diaminobenzidine(DAB) 용액을 가하여 발색 반응을 관찰하면서 10분간 반응시켰다. 물에 수세하여 발색 반응을 끝내고 Harris hematoxylin으로 대조염색하고 탈수한 후 봉입하였다. 양성 대조군으로는 구개편도를 사용하였고, 음성 대조군에서는 일차항체 대신 생리식염수를 이용하여 동일한 방법으로 염색하였다.

판  독
   염색결과 판독은 병리전문의에 의하여 과거의 조직 병리학적, 임상적 정보 없이 시행되었으며, 광학현미경 시야에서 림프절 내의 종양세포 세포질이 적갈색으로 염색되고 형태학적으로 악성세포의 기준에 부합될 때 양성으로 판독하였다. 또한 양성으로 판독된 표본에 해당하는 hematoxylin-eosin 염색 표본을 재검토하여 면역조직화학적 염색 표본과의 관계를 알아보았다.
   본 연구에서 미세전이(micrometastasis)의 정의는 통상적인 hematoxylin-eosin 염색에 의해 발견되지 않고 면역조직화학적 염색에서만 발견되는 종양세포로 정의하였고, 잠재성 전이(occult metastasis)는 림프절내에 종양세포 조각이 존재하는 것으로 정의하였다.

통계학적 분석
   자료의 유의성 검정에서 미세전이가 나타난 림프절간의 원발부위의 조직학적 분화도와 림프절의 크기에 따른 발현빈도의 차이는 Cochran-Mantel-Haenszel Statistics를 이용하여 검정하였고, 유의 수준은 p<0.05로 정하였다.
   또한 미세전이로 인한 예후의 변화를 알아보기 위하여 미세전이로 인해 림프절 병기가 올라간 군과 미세전이가 발견되지 않은 군의 생존율을 Kaplan-Meier 방법을 이용하여 경부병기 pN0, pN1으로 나누어 각각 구하였다. 생존기간은 일차암으로 진단받고 수술적 치료를 시행한 이후부터 연구시작 시기로 잡았고, 통계학적 분석은 log-rank 검사법에 의하여 유의성을 판정하여 p<0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

결     과

   병리조직검사에서 음성으로 진단된 총 1710개의 림프절(mean per patient：24.8±7.4, range：1 to 66) 중 14개의 림프절에서 pancytokeratin 항체에 양성인 세포가 관찰되었다. 병리전문의에 의한 후향적 재검사에서 4개의 림프절에서는 hematoxylin-eosin 염색에서도 전이 부위를 발견할 수 있었고(Fig. 1), 나머지 10개의 림프절에서는 hematoxylin-eosin 염색만으로는 잠재성 미세전이를 발견하는데 불충분한 것으로 나타났다(Figs. 2 and 3). 즉 69예의 환자 검체 중에서 10예(14.5%)에서 림프절 미세전이가 있었다.
   원발부위의 조직학적 분화도에 따른 분포에서 기존의 69예 중에서 저분화형이었던 7예 중 2예에서 미세전이가 발견되어 다른 군보다 미세전이의 빈도가 높게 나타남을 알 수 있었으나, 표본의 숫자가 적어서 통계학적 의의는 없었다(p＝0.513)(Table 2). 미세전이가 발견된 림프절의 직경을 분석한 결과 총 10개의 미세전이 중 5~10 mm 크기의 림프절 474개 중 6개에서 미세전이가 발견되어 가장 많이 발견되었으나, 다른 크기의 림프절과의 비교에서는 림프절의 크기에 따른 미세전이의 발견빈도의 유의한 차이는 발견할 수 없었다(p＝0.08)(Table 3).
   림프절 병기에 따른 분류에서는 잠재성 미세전이로 인해 림프절 병기가 올라간 경우는 총 8예이었으며, 2예에서는 림프절 병기의 변화가 없었다. 이중 pN0에서 pN1이나 pN2로 병기가 올라간 경우는 4예이었고, pN1에서 pN2로 올라간 경우는 2예였다(Table 4).
   pN0에서 pN1으로 병기가 상승한 3예의 예후를 추적 관찰한 결과 2예에서는 각각 28개월과 29개월간 무병생존 중이며 1예에서는 21개월째 폐전이로 인해 사망하였다. pN0에서 pN2로 병기가 올라간 1예에서는 6개월째 국소재발로 인하여 사망하였고, pN1에서 pN2로 병기가 상승한 2예에서는 각각 9개월째 국소재발과 23개월째 폐전이로 인해 사망하였다.
   이상의 6예에서 구한 2년 생존율은 33.3%이었으며 pN0에서 병기가 상승한 4예의 2년 생존율은 50%, pN1에서 병기가 상승한 2예의 2년 생존율은 0%이었다. 같은 병기에서 미세전이가 발견되지 않은 23예 중 pN0인 7예의 2년 생존율은 64%이었고, pN1인 16예의 2년 생존율은 59%였다.
   pN0인 군과 pN1인 군에서 각각 미세전이로 인한 생존율의 차이에 대한 유의성을 검정한 결과는 표본의 수가 적어 의미있는 차이는 없었다(p>0.05)(Figs. 4 and 5).

고     찰

   Cytokeratin은 척추동물에서 세포질의 세포체질을 이루는 성분중의 하나인 7~11 nm 크기의 intermediate filament에 속하며 상피세포에만 존재하는 단백질이다. 일반적으로 림프절을 구성하는 세포에는 발견되지 않으므로 cytokeratin이 발현되는 세포는 종양의 전이로 간주할 수 있다.¹¹⁾¹²⁾ 그러나 Gould 등¹³⁾은 비종양성 림프절염에서 cytokeratin 양성인 간질 세망세포가 증가함을 보고하여서 국소 림프절에서 cytokeratin의 발현을 항상 종양세포의 전이로 간주할 수는 없다고 하였다. 따라서 본 연구에서는 병리전문의가 cytokeratin이 발현된 세포의 형태학적 분석을 하여 핵과 세포질의 비율이 증가하고 다형성을 나타내는 종양세포의 기준에 합당할 때 종양세포의 전이로 간주하였다.
   기존의 두경부 편평세포암종 미세전이의 연구에서는 조직절편의 심부 박절 절편을 얻어 hematoxylin-eosin 염색하여 관찰하는 방법으로 Van de Brekel 등¹⁴⁾이 62예의 림프절 음성 경부청소술 표본에서 2예(3.2%)의 미세전이를 보고하였고, Ambrosch 등¹⁵⁾은 76예의 림프절 음성 경부청소술 표본에서 6예(7.9%)의 미세전이를 보고하였다. 전자의 경우에는 미세전이의 정의를 3 mm 크기 이하의 전이 세포로 정의하였고 후자에서는 2 mm이하의 전이세포로 정의하여서 양자의 결과를 단순 비교할 수는 없고, 각각의 경우에 심부 박절의 깊이도 달라 10 m의 연속 절편을 관찰한 후자의 경우에 좀더 많은 미세전이를 관찰할 수 있었으나 심부 절편 관찰을 통한 일반적인 잠재성 미세전이의 발견 빈도를 알 수 있었다. Cytokeratin 항체를 이용한 면역조직화학적 연구에서는 Enepekides 등¹⁶⁾이 43예의 구강암에서 4예(9.3%)의 미세전이를 보고하였으며 유방암의 연구에서는 보고자에 따라 9~37%의 미세전이 빈도를 보고하였다.¹⁷⁾¹⁸⁾ 이는 미세전이를 검색하는 방법에서 심부 박절보다 면역조직화학적 염색이 더 예민한 방법임을 나타내며, 본 연구의 결과에서도 이를 확인할 수 있었다.
   원발부위의 분화도에 따른 분포에서 분화가 나쁜 경우에 기존 군에 비해서 미세전이의 빈도가 높게 나타남을 알 수 있었고, 이는 세포의 분화도가 나쁜 경우에는 종양세포와 림프구 또는 조직구 등과의 감별이 어려우므로 hematoxylin-eosin 염색에서 간과하기 쉬운 것으로 생각되었다. 또한 림프절 크기에 따른 분포에서 기존의 방사선학적 검사에서 발견하기 어려운 직경 10 mm 이하의 경부림프절에서 미세전이의 빈도가 상대적으로 높은 것에 주목하였는데, 이는 종양세포의 성장속도가 빠른 조기 전이암에서는 조직학적 분화도가 낮고 크기가 상대적으로 작은 종양세포가 증가하여 기존의 hematoxylin-eosin 염색에서 발견하기 어려운 미세전이의 빈도를 상승시키는 것으로 생각되었다. 병기가 낮은 암종에서의 미세전이는 림프절 병기를 상승시키고, 림프절 병기상승은 종양의 국소 재발율을 증가시키므로¹⁹⁾ 경부 청소술 이후에 추가적인 경부 방사선 치료를 고려해야 한다. 따라서 면역조직화학적 염색이 조기전이의 진단과 치료에 중요한 역할을 할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
   본 연구에서 cytokeratin 항체에 양성반응을 나타낸 표본 중 4예는 hematoxylin-eosin 염색 표본의 재검에서 종양세포를 관찰할 수 있었으나 병리의사의 부주의로 놓친 경우였다. 이 결과에서 다른 표본에서도 일정비율의 판독 오류가 있을 것이라는 가정을 할 수 있었고, 이에 반하여 기존의 병리조직검사에서 양성으로 진단된 모든 림프절에서는 면역조직화학 염색상 양성반응을 쉽게 확인할 수 있었으므로, 이는 결과적으로 면역조직화학적 염색의 유용성 증가로 이어질 수 있을 것이라고 생각되었다.
   미세전이로 인한 예후의 변화에서는 미세전이로 인해 림프절 병기가 올라간 군과 미세전이가 발견되지 않은 군 사이에 생존율의 의미있는 차이는 관찰되지 않았다. 미세전이가 발견된 표본의 수가 적고 추적관찰기간도 짧으며 원발부위에 대한 병기가 고려되지 않은 결과이므로 오차요인이 많아서 통계 결과의 해석에는 제한점이 많았다. 그러나 미세전이로 인한 국소재발율의 증가와 생존율의 상관 관계에 대한 이전의 보고에서도 대부분 미세전이로 인한 예후 악화에 대해 통계적 유의성을 발견하지는 못하였다.^10)19)20) 따라서 향후 더 많은 표본의 장기 추적관찰을 통해 미세전이의 예후인자로서의 중요성에 대한 연구가 필요하리라고 사료된다.

결     론

   Cytokeratin에 대한 면역조직화학적 염색법은 두경부 편평세포암종에서 경부 림프절의 잠재성 미세전이의 발견빈도를 높여주며, 특히 분화도가 낮고 종양세포의 크기가 작은 조기 전이암에서 유용하였다. 따라서 기존의 hematoxylin-eosin 염색에서 림프절 음성으로 진단된 조기 암종에서 상용검사방법으로 사용하는 것이 좋을 것으로 생각한다.

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