교신저자：조재식, 501-190 광주광역시 동구 학1동 8번지  전남대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   비인강암은 해부학적 특징 때문에 조기 발견이 어렵고 두개저와 인접하여 수술적 접근이 곤란하고 다른 두경부암들보다 방사선 치료에 더 잘 반응하기 때문에 일차적인 선택으로 방사선 치료가 많이 시도되어 왔다.¹⁾ 방사선 치료에 따른 5년 생존율은 32~62%로¹⁾²⁾ 보고자에 따라 성적이 다양하다. 비인강암은 치료 후 높은 종양 치유율에 불구하고 국소 재발율과 원격 전이의 빈도가 높아서 최근에는 방사선 치료와 항암화학요법의 병행요법이 적극적으로 시도되고 있다. 항암화학요법의 방법으로는 흔히 선행화학요법이 사용되어 왔는데 이는 원발병소 또는 전이 림프절의 크기를 줄여서 방사선치료에 대한 감수성을 증가시키고 미세 전이를 제거하는데 목적이 있다. 선행화학요법을 받은 비인강암 환자에서 생존율이 개선되었다고 보고되고 있지만 아직도 그 효과에 있어서는 논란의 여지가 많다.
   비인강암의 항암화학요법의 주축이 되는 약물은 cisplatin이며 이에 대한 완전관해는 50%까지 보고되고 있다.³⁾ 그러나 cisplatin에 대한 내성에 의해 항암치료의 효과가 저하될 수 있기 때문에 항암제 내성을 미리 예측할 수 있다면 불필요한 항암제의 사용과 방사선치료의 지연을 예방할 수 있을 것이다. Cisplatin 내성 발생기전 중 가장 대표적인 것이 세포내 glutathione(GSH)의 증가이다. GSH는 thiol이 풍부한 물질이며 cisplatin과 반응하여 cisplatin을 불활성시키고, cisplatin 저항성이 나타난 세포주에서는 GSH가 증가한다.⁴⁾⁵⁾ Glutathione S-Transferase(GST)-pi는 GSH와 cisplatin의 결합을 촉진시키는 효소로서, 이 효소의 작용으로 cisplatin-GSH complex는 세포밖으로 배출되게 된다.⁶⁾ Multidrug resistance associated protein(MRP)는 multidrug resistance(MDR)⁷⁾ -associated me-mbrane-bound protein의 일종⁶⁾으로 cisplatin이 직접 multidrug resistance(MDR)를 유발하지는 않지만 MDR이 발생한 세포가 cisplatin에 대해 교차내성을 나타낸다고 보고되고 있다.⁸⁾
   GST에 대한 연구에서 Nishimura 등⁹⁾은 두경부암에서 GST 발현이 cisplatin을 기본으로 하는 항암화학요법의 반응과 상관관계가 있다고 하였고 Shiga 등¹⁰⁾은 GST-pi가 선행화학요법을 받은 두경부암 환자에서 생존에 대한 임상적 예측인자라고 주장하였다. Tsuzuki 등¹¹⁾은 소수의 비인강암을 포함한 두경부암에서 MRP와 임상인자와의 관계를 분석하여 MRP는 생존율 및 항암제 감수성과 관계가 없었다고 보고하였다.
   GST-pi 및 MRP 등에 대한 연구는 두경부암 분야에서 산발적으로 시행되어 왔으나 비인강암을 대상으로 한 연구는 미미한 실정이다. 이에 저자는 비인강암 환자에 대해서 MRP, GST-pi의 발현의의를 파악하고 MRP와 GST-pi의 발현정도가 여러 임상인자들과 cisplatin을 기본으로 하는 항암화학요법에 대한 반응에 어떠한 영향을 끼치는지에 대해 조사하였다.

대상 및 방법

대  상
   1989년 1월부터 1996년 12월까지 이비인후과에 내원하여 비인강암으로 진단받았던 환자 중 의무기록을 통한 후향적 조사가 가능했던 82명을 대상으로 하였다. 82명 중 파라핀 조직이 보존되었던 경우는 57명이었으며 이중 항암화학요법이나 방사선 치료를 시행하고 파라핀 조직이 보존된 49명을 대상으로 MRP와 GST-pi에 대한 조사를 시행하였다. 항암화학요법은 cisplatin 100 mg/m²를 1회 투여하고 추가로 하루에 5-FU(fluorouracil) 1000 mg/m² 또는 peplomycin 10 mg을 5일간 투여하였고 1~3 cycle을 시행하였다.

면역조직화학적 검색
   10% 중성 완충 포르말린에 고정한 후 제작된 파라핀 절편을 약 4 μm두께로 잘라서 Probe-On 슬라이드에 부착시켜 건조시킨 후에 염색에 이용하였고 염색의 전 과정은 Probe-On 슬라이드를 맞대어 생기는 capillary gap action의 원리를 이용한 Microprobe Immuno/DNA염색기(Fisher Sci-entific, USA)를 이용하여 시행하였다. 파라핀 절편이 부착된 슬라이드를 탈파라핀 함수과정을 거쳐 내재성 과산화효소를 억제하기 위해 autoblocker(Research genetics, AL, USA)에 반응시키고 각각에 대한 1차 항체로서, MRP에 대한 항체는 mouse anti-human MRPm 6항체(Monosan, Netherlands)를 1：100으로 희석하여 사용하였고 GST-pi에 대한 항체로는 rabbit anti-human GST 항체(MBL, Nagoya, Japan)를 1：1000으로 희석하여 사용하였다. 1차 항체의 검출을 위한 2차 항체는 universal secondary antibody(Research genetics, AL, USA)를 부착시키고 검출을 위해 streptavidin-horseradish peroxidase를 이용하여 부착시키고 발색을 위하여 3-amino-9-ethylcarbazole(AEC)(Research genetics, AL, USA)를 이용하였다. MRP에 대한 염색에서는 microwave oven을 이용한 전처리를 추가적으로 시행하였다. MRP와 GST-pi의 양성 대조군으로 갑상선 조직을 이용하였다. 각각의 발현율에 대해서는 전체 암세포의 25%이상 발현된 경우를 고발현, 25%미만을 저발현이라고 정의하였다.

통계학적 분석
   MRP 및 GST-pi와 임상인자 및 항암화학요법의 반응도의 관계에 대해 Chi-square를 이용하여 분석하고 생존률과의 관계는 Kaplan-Meier법과 Log-Rank법을 이용하였고 p값이 0.05이하인 것을 의의있는 것으로 산출하였다.

결     과

대상군
   전체 대상 환자 49예의 연령분포는 20~75세로서 평균 연령은 53세였고 중앙값은 54세였다. 성별 분포는 남자가 37명(75.5%)였고, 여자가 12명(24.5%)이였다. WHO분류에 의한 조직학적 유형은 제 1 형이 4예(8.2%), 제 2 형은 29예(59.2%), 제 3 형은16예(32.7%)를 보였다.
   병기는 환자의 의무기록지에 근거하여 미국 암합동위원회(AJCC, 1997) 병기분류법³³⁾에 따라 후향적으로 다시 분류하였다. T1, T2a, T2b, T3, T4는 각각 14예(28.6%), 5예(10.2%), 7예(14.3%), 5예(10.2%), 18예(36.7%)였다. 림프절 침범상태는 N0, N1, N2, N3a, N3b는 각각 7예(14.3%), 21예(42.9%), 14예(28.6%), 4예(8.2%), 3예(6.1%)였다. 병기군별 분포는 제 I, 제 II, 제 III, 제 IV 기에서 각각 2예(4.1%), 12예(24.5%), 13예(26.5%), 22예(44%)를 보였다.
   대상환자 49명 중 항암화학요법과 방사선치료가 병행된 경우는 43예였고 항암화학요법만 시행했던 경우가 6예였다. 항암치료의 경우 1~3 cycle을 시행하였고 사용약물은 cisplatin, 5-FU, peplomycin이였다. 병합요법을 시행한 43예 중 cisplatin과 5-FU를 사용했던 경우는 31예(72%)였고 cisplatin과 peplomycin을 사용한 경우는 12예(28%)였으며 방사선치료없이 항암화학요법만을 시행했던 6예중 5예에서는 cisplatin과 5-FU, 1예는 cisplatin과 peplomycin를 투여하였다. 그리고 방사선 치료는 평균 7020 cGy를 시행하였다.

MRP 발현
   총 49예에서 MRP가 고발현된 경우는 20예(40.8%), 저발현된 경우는 29예(59.2%)였다(Fig. 1).
   성별에 따른 MRP발현은 통계학적 의의가 없었으며 54세를 기준으로 연령을 두 군으로 나누었을 때 54세 이상인 군에서의 고발현율은 58.3%, 54세 미만인 군에서는 35.1%였고 통계학적 유의한 차이는 없었다.
   WHO분류에 의한 조직학적 유형에 따른 고발현율은 제 1 형이 75%, 제 2 형에서 41.1%, 제 3 형에서 31.3%를 보였고 이들 간의 통계학적 유의한 차이는 보이지 않았다.
   T병기에 따른 MRP의 고발현율은 T1에서 35.7%, T2에서 41.7%, T3에서 40.0%, T4에서 44.4%였고 T병 기간의 통계학적 유의한 차이는 없었다. 림프절 전이군에서의 고발현율은 38.1%, 비전이군에서는 57.1%를 보였고 이들 간의 통계학적 유의한 차이는 보이지 않았다. 초기 병기군에서 고발현율은 35.7%, 진행된 병기군에서 고발현율은 42.9%였고 이들 두 군간의 통계학적 유의한 차이는 보이지 않았다.
   항암화학요법 후 부분반응¹²⁾ 이상을 보인 군에서 MRP의 고발현율은 34.6%, 소반응¹²⁾을 보인 군에서 고발현율은 47.8%였고 이들 두 군간의 통계학적 유의한 차이는 보이지 않았다. MRP와 생존율과의 관계도 통계학적 의의가 없었으며, MRP와 방사선치료 반응과도 통계학적 의의가 없었다(Table 1).

GST-pi 발현
   총 49예 중 고발현된 경우는 41예(83.7%), 저발현된 경우는 8예(16.3%)를 나타냈다(Fig. 2).
   성별에 따른 고발현율은 남성에서는 86.52%, 여성은 75.0%였고, 54세 이상인 군에서의 고발현율은 85.7%, 54세 미만인 군에서는 81.1%로서 통계학적 유의한 차이는 없었다.
   조직학적 유형에 따른 고발현율은 제 1 형이 100%, 제 2 형에서 79.3%, 제 3 형에서 87.5%를 보였으나 통계학적으로 유의한 차이를 보이지 않았다.
   T병기에 따른 고발현율은 T1에서 71.4%, T2에서 91.7%, T3에서 80.0%, T4에서 88.9%로서 통계학적 유의한 차이는 없었다. 림프절 전이군에서의 고발현율은 81.0%, 비전이군에서는 100%를 보였고 두 군간의 통계학적 유의한 차이는 없었다. 초기병기군에서 고발현율은 64.3%, 진행된 병기군에서 고발현율은 91.4%로서 이들 두 군간은 통계학적 유의한 차이를 보였다(p＝0.020). 항암화학요법의 반응정도와 GST-pi의 발현에서 부분반응 이상을 보인 군에서 고발현율은 84.6%, 소반응을 보인 군에서 고발현율은 82.6%였고 이들 두 군간의 통계학적 유의한 차이는 보이지 않았다. GST-pi 발현정도와 생존율과의 상관관계와 방사선치료 반응정도와의 상관관계도 통계학적으로 유의하지 않았다(Table 2).

고     찰

   비인강암의 발생 연령 분포는 10대에서 70대까지 보고되고 있으며 평균 40~50대에서 가장 많이 발생하는 것으로 알려져 있고 남녀 성비는 2.2~3.4：1로 보고되고 있다. 본 연구에서도 연령분포는 17~75세였고 남녀 성비도 다른 보고들과 비슷한 양상을 보였다.
   항암화학요법은 그 효용성에 대해서는 아직 논란이 많다. 약제로는 cisplatin, bleomycin, cyclophosphamide, vincristine, methotraxate 등이 사용되고 있으며 Rossi 등¹³⁾의 보고에 의하면 non-cisplatin based chemotherapy의 경우에서는 생존율의 향상은 보이지 않는다고 하였고 cisplatin의 경우가 다른 약제에 비해서 더 좋은 결과를 나타내는 것으로 보고하고 있다.¹⁾ Cisplatin을 포함한 항암화학요법으로 생존율이 증가한다는 보고³⁾가 있는 반면에 오히려 생존율의 증가 없이 합병증이 많아진다는 Tannock 등¹⁴⁾의 보고가 있어 왔으며 병행요법의 방법에 다소간 차이가 있지만 최근 연구들¹⁵⁾¹⁶⁾에서는 항암화학요법을 병행시 생존율의 증가를 보이는 것으로 발표되고 있다.
   Cisplatin에 대한 두경부 종양의 반응이 환자마다 각기 다르게 나타나는 것을 Vokes 등¹⁷⁾이 보고하였고, cisplatin에 대한 내성에 대해서는 Hayes 등¹⁸⁾에 의해 많은 기전들이 제안되었는데 세포내 cisplatin 농도의 감소, glutathione의 증가, metallothionein의 증가, DNA복구촉진, 미토콘드리아막 전위의 변화 그리고 암유전자 발현 및 신호전달 증가 등이 관여한다고 알려져 있다.⁴⁾ 그 중에 GSH가 cisplatin에 대한 내성의 발현에 중요한 역할을 한다는 보고가 있고¹⁹⁾ Glutathione(GSH)은 thiol기가 풍부한 물질로 cisplatin과 결합하여 cisplatin의 효과를 감소시키는 역할을 하는 것으로 알려졌다.⁴⁾ GSH의 합성을 억제하는 buthionine sulfoximine(BSO)를 투여했을 때 GSH의 농도가 감소하면 cisplatin 독성이 증가한다고 하며²⁰⁾ Nishimura 등²¹⁾은 GSH의 세포내 농도와 cisplatin의 IC50가 밀접한 상관관계가 있어 두경부종양에서 cisplatin에 대한 내성을 발생시키는데 GSH가 주요 역할을 한다고 하였다. Glutathione S-transferases(GST)-pi는 GSH와 cisplatin의 결합을 촉진시키는 역할을 하는 효소로 cisplatin과 GSH의 결합물질은 glutathione S-conjugate export(GS-X) pump를 통해 밖으로 배출된다.⁶⁾ 그래서 GSH의 농도와 GST의 활성도 증가가 약물 내성과 관계가 있으며 GSH농도와 GST-pi의 활성도가 종양에서 항암화학요법의 내성에 대한 예측인자로서의 유용하다는 보고가 있다.²²⁾ MRP는 ABC(ATP binding cassette) transporter 단백질로서 약물내성을 일으키며 여러 암종에서 MRP발현²³⁾ 이 알려지고 있으며 발현정도와 생존율의 저하가 관계가 있다는 많은 보고들이 있다. Cisplatin내성의 발생에 있어서 MRP의 기전은 cisplatin에 의해 직접적으로 MRP의 발현이 증가하지는 않고 MDR이 유발된 세포가 cisplatin에 대해 교차내성을 일으키는 것으로 설명되어지고 있다.¹⁴⁾ MRP이외에 MRP2, MRP3, MRP4, MRP5, MRP6 등이 새로이 발견되었는데²⁴⁾ 그 기능에 대해서는 연구가 진행중인 상태이다. 그러나 두경부암과 MRP의 발현과의 관계에 대한 연구에서 Welters 등⁶⁾은 IC50과 MRP의 상관관계가 역비례하기 때문에 다른 항암제내성인자에 대한 연구가 필요하다고 하였으며 Tsuzuki 등¹¹⁾은 두경부암에서 MRP발현과 생존율과의 관계는 통계학적 유의성이 없다고 하였으며 in vitro에서 항암화학요법의 반응에 대한 예측인자로서의 유용성도 높지 않다고 하였다.
   본 연구에서 GST-pi의 발현정도가 성별, 연령, 조직학적 유형, T병기, N병기, 임상적 병기군에 따라 어느 정도 차이가 있는지를 조사하였는데 초기병기군과 진행된 병기군에서만 통계학적으로 유의한 차이를 보였다. MRP의 발현정도와 그 외의 임상적 인자들과의 관계에서는 통계학적 유의한 차이가 나타나는 인자들은 없었다. GST-pi와 MRP의 발현정도와 항암화학요법의 반응 및 생존율의 상관관계도 통계학적인 의의는 없어 본 연구에서는 GST-pi와 MRP가 예측인자로서의 유용성은 없었다. 저자의 MRP에 대한 결과는 Welters 등⁶⁾과 Tsuzuki 등¹¹⁾의 결과와 일치하였다.
   Cheng 등²⁵⁾의 연구에서는 항암화학요법의 치료전의 암조직과 치료후의 암조직에서 GST-pi의 발현정도를 비교하여 내성이 있는 군에서 발현율이 높다고 발표하였다. 본 연구에서는 항암화학요법 시행 전의 암조직에서의 발현정도만을 가지고 항암화학요법에 대한 내성과 비교하였으나 항암화학요법 후의 암조직과의 발현비율을 조사하여 항암화학요법의 내성 예측인자로서 유용성을 파악하는 것도 필요할 것으로 생각된다.

결     론

   본 연구에서는 항암화학요법의 반응에 대한 예측인자로서 GST-pi와 MRP발현은 통계학적 의미가 없었기 때문에 cisplatin 내성 및 감수성에 관여하는 다른 인자들에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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