교신저자：민양기, 110-744 서울 종로구 연건동 28번지  서울대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   알레르기성 비염은 여러 기전에 의해서 매개되지만 지속적인 노력에도 불구하고 명확한 기전은 밝혀지지 않고 있다. 알레르기성 비염에서 비반세포의 역할이 알려져 있으나 알레르기 염증이 있는 국소 조직에서 비반세포의 활성과 침윤이 증가하는 기전은 확실히 규명되지 않았다. 비반세포는 급성 알레르기 반응에 관여하는 주된 세포로서 히스타민을 포함한 여러 화학 매개체를 분비하여 다양한 알레르기 반응을 유발한다.¹⁾ 그러나 비반세포의 비강 내에서의 기원과 변화 등에 대해서 명확한 기전은 밝혀져 있지 않다.
   알레르기성 비염이나 비용종 등과 같은 만성 염증성 반응이 있을 때 비반세포가 국소적으로 증가함은 알려져 있으며 최근 이와 같은 질병이 있을 때 상피세포, 섬유아세포, 혈관내피세포 등에서 stem cell factor(SCF)의 분비가 증가되어 있음이 밝혀졌다.²⁾³⁾⁴⁾ 그러나 실제로 SCF의 투여가 기도 점막에서 비반세포의 침윤이나 활성을 증가시키는지는 밝혀져 있지 않다.
   현재 알레르기 기도 질환에 대한 여러 치료 방법들은 비특이적으로 염증 반응을 감소시키는 것들이다.⁵⁾ 이렇듯 제한적인 치료법은 알레르기 기도 염증에 대한 충분하지 못한 이해에 기인한 것이라고 할 수 있다. 그러므로 알레르기 염증 기전에 대한 이해는 새로운 치료법의 개발에 있어서 매우 중요하다. 알레르기 비염의 병인에서 SCF의 역할을 밝히면 이를 이용하여 알레르기성 비염, 비용 등에서 중요한 역할을 하는 비반세포를 억제하는 새로운 치료 방법 개발의 가능성이 있을 것이다.
   본 연구는 SCF의 비내 투여 효과를 관찰하고 알레르기 비염의 병인에 있어서 SCF의 역할을 생체에서 규명하기 위하여 시행하였다.

재료 및 방법 

마우스에서 난알부민 감작에 의한 알레르기성 비염 유도와 비강내 유발검사
   생후 3주령의 BALB-c 마우스((주)대한실험동물) 수컷들(15~25 g)을 specific pathogen free(SPF) 환경에서 40일간 사육하였다. 
   이전에 본 실험실에서 발표하였던 대로⁶⁾ 난알부민(ovalbumin, chicken egg albumin, grade V, Sigma Chemical Co. Phillipsberg, NY) 10 μg과 aluminum hydroxide (AL(OH)3) gel 1 mg을 생리 식염수 0.5 ml에 30분 이상 혼합하여 2 mg/ml Al(OH)₃에 흡착된 10 μg의 난알부민 혼합액 1 ml를 만들었다. 이 혼합물 0.1 ml을 수컷 BALB-c 마우스의 복강 내에 주사하고, 5일째와 21일째에 각기 한번씩 더 주사하였다. 마지막 복강 내 주사 1주일 후(28일째) 마우스를 옆면의 구멍에 분무기가 연결된 200×220×200 mm 크기의 아크릴 상자에 넣고 1% 난알부민의 용액으로 분무기(PulmoAide, DeVillbiss, Somerset, Pa)를 이용하여 30분간 분무하였다. 이 과정을 1일 1회씩 5회 시행하여 비강 내 국소감작을 실시하였다. 
   이러한 방법으로 알레르기성 비염을 유도한 40마리의 마우스를 이용하여 국소 감작 종료 후 7일째에 비강내 투여 유발검사를 시행하였다.
   생리식염수에 희석시킨 recombinant mouse SCF(rmSCF, R & D system, Minneapolis, Minn.) 5 nM, 50 nM, 500 nM를 각각 포함한 50 μl의 용액을 마이크로피펫을 이용해서 좌, 우측 비공에 각각 25 μl씩 주입하였다.
   전체를 각각 5마리씩 여덟 군으로 나누었다. 제 1 군은 음성대조군으로서 phosphate buffer saline(PBS)을 비강 내에 투여하여 유발시험을 하였다. SCF에 의한 유발반응의 농도의존성을 확인하기 위해 제 2, 제 3, 제 4 군은 각각 3가지 농도(5 nM, 50 nM, 500 nM)의 rmSCF를 비강내 투여하여 유발시키고 1시간 후에 검사하였고, 시간의존성을 확인하기 위해 제 4 군에 이어 제 5, 제 6 군은 500 nM의 rmSCF를 비강내 투여하여 유발시키고 각각 4시간, 24시간 후에 검사하였다. 제 7, 제 8 군은 양성대조군으로서 5% 난알부민 용액을 30분간 분무하여 유발시키고 각각 1시간과 24시간 후에 검사를 실시하였다(Table 1).

알레르기 증상 변화의 관찰
   각 군에서 비강내 유발을 시행한 후 일정한 시간에 15분간 각각의 마우스에서 재채기 횟수와 코를 긁는 동작의 횟수를 측정하여 이들의 합을 증상점수(symptom score)로 기록하였다. 2명의 관찰자가 측정한 점수의 평균을 증상점수로 기록하였고 관찰자간의 차이가 30% 이상인 경우는 제외하였다. 

비강세척액의 히스타민 정량 분석 
   마우스를 ketamine HCl(10 mg/kg) 복강 내 주사로 마취한 후 3번째 기관륜(tracheal ring)과 4번째 기관륜 사이에서 기관절개술(tracheotomy)을 실시하고 25 gauge 정맥카테터를 기관절개구(tracheotoma)에 넣어 카테터끝을 후비공(choana)까지 삽입하였다. 1 ml의 PBS를 카테터를 통해 비강에 주입하고 50 ml 튜브에 비강세척액을 수집하였다. 평균 0.7 ml의 비강세척액이 수집되었고 비강세척액을 4000 g에서 5분간 원심분리하여 얻은 상청액을 영하 20°C에 보관하였다. 
   비강세척액 내의 히스타민의 정량분석은 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)를 이용하였으며 상용화되어 있는 kit(Ama, Inc, Westbrook, MA)를 사용하였다. 
   영하 20°C에 보관되어 있던 비강세척액의 상청액을 실온에서 녹여서 25 μl의 acylation 완충액이 들어있는 플라스틱 튜브에 넣은 후 25 μl의 acylation 반응액을 넣어서 acylation시켰다. 이미 항히스타민 단클론항체가 코팅되어 있는 96-well microtiter plate에 acylation 시킨 표준액들과 각 군의 비강세척액의 상청액 50 μl를 넣었다. Histamine-alkaline phosphatase conjugate 200 μl를 섞은 후 4°C에서 18시간 동안 반응시켰다. 3회 세척한 후 기질로서 200 μl의 para-nitrophenylphosphate를 넣어서 빛을 차단한 상태에서 microtiter shaker에서 350 rpm으로 섞으면서 반응시켰다. 50 μl의 정지액을 넣어서 반응을 정지시킨 후 분광측정기에서 405 nm의 흡광도를 측정하였다.

조직학적 검사
   모든 군의 마우스는 알레르기 증상점수의 측정과 비강세척액 채취가 종료된 후 탄산가스를 흡입시켜서 안락사시켰다. 마우스의 머리를 분리시킨 후, 10% 포르말린액에 24시간동안 고정시킨 후에 마우스의 두부로부터 피부를 제거하고 탈석회액(decalcifier B, Accra Lab, Swedesboro, NJ)에 24시간동안 담갔다. 비강조직을 파라핀에 넣은 후 5 μm두께로 관상면(coronal section)으로 잘랐다. Haematoxylin과 eosin(H & E)염색을 실시하여 광학현미경 하에서 마우스 비강의 관상면에서 두개의 이빨이 보이는 조직을 선정하였고, 하비갑개(inferior turbinate)의 전반부에서 400배 배율에서 점막하의 호산구의 숫자를 측정하였다.

통계처리방법
   본 연구에서 얻은 측정치는 Mann-Whitney U-test를 이용하여 통계분석을 실시하였고 SPSS for windows version 10.0(SPSS Inc., Chicago, Ill)을 이용하였고 p<0.05를 통계적으로 의미 있다고 하였다.

결     과

알레르기 증상점수
   증상점수는 제 1 군에서 제 8 군까지 각각 18±5, 23±13, 29±8, 31±10, 21±7, 17±7, 37±13, 17±6 이었다. 
   SCF의 용량이 증가함에 따라 증상점수는 점차 증가하였고(제 2, 제 3, 제 4 군) 제 1 군과 비교하였을 때 50 nM 및 500 nM의 rmSCF를 비강내 투여하여 유발한 후 1시간에 알레르기 증상을 측정한 군(제 3 군, 제 4 군)에서 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p<0.05). 이러한 증상점수는 4시간, 24시간 이후에는 음성대조군과 유의한 차이가 없었다. 양성대조군으로 난알부민으로 유발한 군도 첫 1시간 후에는 음성대조군과 유의한 차이를 보였지만, 24시간 후에는 유의한 차이가 없었다(Fig. 1). 

비강세척액의 히스타민 정량분석
   제 1 군의 히스타민 농도는 1.31±0.4 nM이었다. 제 2, 3, 4 군의 히스타민 농도는 각각 1.53±0.5 nM, 1.72±0.5 nM, 3.62±1.8 nM로서 제 1 군과 비교하여 SCF의 농도가 증가함에 따라 점차 증가하는 경향을 보였지만, 제 4 군만 음성대조군보다 통계학적으로 의미 있게 증가하였다. 시간과의 관계를 보기위해 500 nM의 rmSCF로 비내 유발을 실시하고 각각 4시간, 24시간 후에 비강세척을 시행한 군(제 5 군, 제 6 군)의 히스타민 농도는 각각 1.75±0.9 nM, 1.33±0.6 nM로서 음성대조군과 통계학적으로 의미 있는 차이가 없었다. 양성대조군 중 1시간 후에 비강 세척을 시행한 제 7 군의 히스타민 농도는 2.35±1.1 nM로서 통계학적으로 의미는 없었지만(p=0.09) 음성대조군과 비교하여 많은 증가를 보였고, 유발 24시간 후에 비강 세척을 시행한 제 8 군의 히스타민 농도는 1.35±0.4 nM로서 음성대조군과 의미 있는 차이가 없었다(Fig. 2). 

조직학적 검사 
   PBS를 비강내 투여한 후 1시간에 조직을 채취한 군(제 1 군)에서는 11.2±3.5개의 호산구가 관찰되었다. 호산구의 증가는 유발한 rmSCF의 농도와 시간에 비례하여 증가하는 양상을 보였고 500 nM의 rmSCF로 비내 유발을 시킨 후 24시간에 조직을 채취한 제 6 군과 난알부민으로 유발시킨 후 24시간에 조직을 채취한 제 8 군에서 호산구의 숫자는 각각 17.6±3.2개, 18.4±3.4개로서 음성대조군과 비교하여 통계학적으로 의미 있게 증가하였다(Fig. 3).

고     찰

   비반세포의 화학매개체의 생산, 탈과립 및 유리에 영향을 미치는 인자로서 SCF가 주목받고 있다. 현재까지의 문헌 검색에 따르면 알레르기성 비염이 유발된 동물의 생체에서 SCF의 비강내 투여 후 알레르기 증상의 변화, 비강세척액의 히스타민의 농도 변화를 증명한 연구는 아직 없었다. 본 연구는 SCF를 직접 마우스의 비강에 점적함으로써 나타나는 증상과 생화학적인 변화를 관찰함으로써 SCF의 알레르기성 비염에서의 역할을 생체에서 규명하고자 하였다.
   마우스에서는 IL-3, IL-4, IL-9, IL-10 및 nerve growth factor(NGF), SCF 등이 비반세포의 분화와 증식에 관련되어 있고 사람에서는 SCF가 비만세포의 분화에 직접 관여한다고 알려져 있다.⁷⁾⁸⁾⁹⁾
   SCF는 mast cell growth factor, c-kit ligand 또는 steel factor 등으로도 알려져 있다. 제대혈세포(cord blood cell)를 배양액만을 이용하여 배양하면 비반세포를 얻을 수 없었으나 BALB-c 마우스의 3T3 섬유아세포와 같이 배양하면 비반세포를 얻을 수 있었다. 섬유아세포에서 비반세포의 성장에 필요한 인자가 있는 바 이것이 SCF임이 밝혀졌다.²⁾ SCF는 흰쥐의 골수세포와 함께 배양하였을 때 비반세포의 증식을 유발한다. SCF는 인체의 골수와 제대혈을 비반세포와 함께 장기간 배양하였을 때 비반세포의 성장에 필수적인 요소로 작용하고, 미성숙 비반세포의 성숙에도 관여한다.¹⁰⁾ SCF를 흰쥐에 피내 주사할 경우 비반세포 의존성 급성 염증 반응과 비반세포의 유주를 유발시키고,¹¹⁾ 흰쥐의 비반세포에 있어서 IgE에 의한 탈과립반응을 증진시킨다.¹²⁾ 또한 흰쥐에 SCF를 피내 주사하면 피부의 비반세포로부터 탈과립화를 유발시키며, 인체에 있어서도 제대혈로부터 추출한 비반세포에 IL-6와 함께 SCF를 첨가하여 배양하면 히스타민의 분비를 유발한다.¹³⁾ 이러한 SCF의 비반세포 주화작용은 SCF blocking Ab를 첨가하면 그 작용이 감소한다.¹⁰⁾ 따라서 SCF는 비반세포의 성장, 분화, 주화, 부착, 화학매개체의 분비 등에 작용하고 있음을 유추할 수 있다. 
   본 연구의 결과를 요약해보면 실험적으로 유발한 알레르기 비염모델에서 SCF로 기도반응을 유발시킨 군에서 PBS 만을 준 음성대조군에 비해 SCF의 용량에 비례하여 알레르기 증상의 증가와 비강세척액에서 히스타민의 증가를 관찰할 수 있었고, 500 nM의 일정용량의 SCF로 유발 후 시간별로 관찰하였을때 유발 1시간 후가 가장 알레르기 증상 및 히스타민의 증가가 두드러졌고 이후 점차 감소하는 경향을 보였다. 또한 알레르기 후기반응에 관여하는 호산구는 유발한 SCF의 용량과 유발 후부터 관찰까지의 시간에 비례하여 증가하는 경향을 보였다. 
   따라서 본 연구의 결과와 문헌고찰을 통해보면 재채기나 코를 비비는 행동 등 알레르기 비염의 급성 증상은 비반세포로부터 화학 매개체의 분비에 의하며, SCF가 국소조직 내의 비반세포의 탈과립화와 급성 매개체의 유리에 의하여 알레르기 증상의 증가를 유도했을 것으로 추정할 수 있다. 또한 SCF를 투여한 군에서 비강세척액 내의 히스타민의 양이 증가한 사실은 SCF의 비강내 투여가 히스타민의 분비를 유도하고 알레르기 증상을 일으켰다는 것을 시사한다. 다만 본 연구의 문제점은 SCF가 비특이적인 자극을 유발하여 위와 같은 결과가 SCF의 용량에 비례하여 증상점수와 히스타민이 증가했을 가능성을 배제하지 못했다는 점이다. 이런 가능성을 배제하기 위해 향후 유발하는 SCF의 osmolality와 같은 양의 비자극성 물질의 비강내 주입한 군을 음성대조군에 포함시켜야 할 것으로 사료된다.
   또한 SCF를 비내 투여하고 시간의 경과에 따라 호산구가 증가한 결과로부터 SCF에 의해 유발된 알레르기성 염증반응이 호산구에 의해 매개되는 후기 반응과도 연관이 있을 것임을 시사한다. 이는 비반세포에서 분비되는 강력한 호산구의 화학주성인자인 platelet activating factor(PAF)에 의해서 호산구의 유입이 증가되었을 것으로 추측할 수 있다. 
   이상의 연구결과로부터 SCF의 비내 투여로 유발된 초기 알레르기성 반응으로 비강세척액 내의 히스타민 양의 증가와 알레르기 증상의 발현, 그리고 후기 반응으로 호산구의 동원을 관찰함으로써 SCF가 알레르기 비염의 병인에서 중요한 역할을 하고 있음을 추정할 수 있다.

결     론

   난알부민에 의해 유발된 알레르기성 비염 마우스에서 SCF의 비강 내 투여 후 알레르기 증상의 발현의 증가와 비강세척액에서 히스타민의 증가, 비강 조직 내에서의 호산구의 증가를 관찰하였다. 이러한 연구 결과는 SCF가 알레르기 비염의 병인에서 중요한 역할을 하고 있음을 시사한다. 

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