교신저자：김민식, 137-701 서울 서초구 반포동 505  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   구강설 편평세포암종은 임상병기 등의 형태학적 관점을 통해 암종의 침습과 전이를 예측하여 왔다. 최근 이를 분자생물학적 측면에서 다루고자 하는 시도가 이루어지고 있는데, 여러 물질들 중에서도 특히 세포간 유착에 관여하는 세포부착분자와 기저막 침습에 관여하는 단백분해효소의 발현에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.¹⁾ 세포부착분자에 이상이 발생하면 세포 표면에서 물질 이동과 세포 이동력이 변형되어 종양의 다양한 형태학적 소견 및 진행과 전이 방식을 나타낼 것으로 추측되며, 이들 중 칼슘 의존성의 E-cadherin은 거의 모든 상피세포간의 유착 접합부(adherens junctions) 형성에 관여하며 이의 발현이 저하되면 상피세포가 그 특성을 소실하고 유착력이 약화되어 주위 기질로의 침습력이 증대되는 것으로 알려졌다.²⁾ 단백분해효소는 종양세포에서 분비되어 세포기질의 단백질을 분해하며 이중 금속함유 단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMPs)의 한 아형인 matrix metalloproteinase-2(MMP-2)는 아연의존성 단백분해효소로서 기저막의 성분인 제 4형 교원질을 분해하여 종양세포의 악성도와 밀접한 관련성을 가진다고 알려져 있다.³⁾
   현재까지 이들 물질의 종양과의 연관성에 관한 연구가 위선암, 전립선암, 유방암등 여러 영역의 종양에서 활발히 이루어지고 있으나 두경부 편평세포암종, 특히 구강설 편평세포암종에 대한 연구는 아직 미흡한 실정이다. 이에 본 연구에서는 구강설암에 대한 수술적 치료를 시행받은 25예의 환자들을 대상으로 이들의 수술조직절편에서 E-cadherin과 MMP-2에 대한 발현을 관찰하여 종양의 국소병기와 림프절 전이 여부, 조직학적 분화도에 대한 관련성을 분석하고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   1995년부터 2001년까지 이비인후과에서 구강설암으로 진단받아 수술을 받고 조직학적으로 확인한 구강설 편평세포암종 환자 25명을 대상으로 하였다. 이들을 국소병기에 따라 조기암인 경우(T1, T2)와 진행암인(T3, T4)경우로 나누고, 다시 조기암의 경우를 절제조직에서 확인된 경부림프절 전이 유무에 따라 세분하였다. 진행암의 경우는 전 예에서 림프절침범이 관찰되어 림프절전이여부에 따른 분류를 시행하지 않았다. 임상병기는 AJCC(American Joint Committee on Cancer, 1997)의 분류법을 따랐다. 조직학적으로는 절제조직에 대한 암종의 분화도에 따라 고분화(well-differentiated)암종인 경우와, 중등도 분화(moderately differentiated) 또는 미분화(poorly differentiated)암종인 경우로 분류하여 면역조직화학염색 결과와 비교, 분석하였다. 총 25예의 대상환자들의 성별은 남자가 19명(76%), 여자가 6명(24%)이었으며, 연령 분포는 23세부터 86세까지였고 평균 연령은 56.5세였다. 분화도에 따른 분류는 고분화 암종군이 13예, 중등도 분화 또는 미분화 암종군이 12예였다. 임상적 병기에 따른 분류에서는, 조기암군(T1, T2)이 17예, 진행암군(T3, T4)이 8예였고 조기암군 중 경부림프절 전이가 없는 군(N0)이 9예, 경부림프절 전이가 있는 군(N+)이 8예였다.

면역조직화학염색
   상기 기술한 25예의 파라핀 포매조직을 가능한 한 정상 조직이 포함되도록 5 μm 두께로 박절하였다. 이 절편들을 58℃ 오븐에서 15분간 건조시키고 xylene으로 실온에서 2분간 4회 반복 처리하여 파라핀을 제거한 뒤 10% citrate 완충액에 침수시켜 microwave에서 5분간 가열하였다. 조직내 내인성 과산화효소 활성을 저지시키기 위해 0.3% 과산화수소수에 30분간 전처리한 후 증류수에 수세하고, 비특이적인 단백과의 결합을 방지하기 위하여 비면역 말혈청에서 20분간 반응시킨 뒤 따라버리고 다시 증류수로 수세하였다. 일차항체로 E-cadherin(Zymed, San Francisco, CA)과 MMP-2(Oncogene Research Products, San Diego, CA)를 각각 1：100으로 common antibody diluent solution(BioGenex, San Ramon, CA)으로 희석하여 4℃ 온도에서 야간 방치한 뒤 인산완충액으로 2분간 2회 세척하고 biotinylated anti-mouse rabbit 면역 글로불린을 37℃에서 30분간 반응시켜 다시 인산완충액으로 2분간 2회 세척하였다. 과산화효소-streptavidin 표지시약으로 30분간 반응시킨후 적갈색의 기질을 형성하는 AEC(3-amino-9-ethylcarbazole)을 이용하여 발색한 뒤 Mayer’s hematoxyline 용액으로 대조염색을 시행하여 광학 현미경으로 관찰하였다. 조직내 암종의 침범이 없는 정상 상피부분의 염색정도를 암종의 염색정도와 비교하였다. 

염색결과의 판독
   판독 중 편이를 예방하기 위하여 한 명의 관찰자에 의해 분류된 조직을 무작위로 추출하여 관찰하였으며, 먼저 저배율(×40, ×100)시야에서 기저막을 뚫고 실질내로 침범한 암소(cell nest) 중 염색상이 잘 되어 있는 부분을 선정하여 200배 또는 400배의 고배율 확대 시야에서 관찰하였다. E-cadherin은 정상 편평상피에서 세포막을 따라 진한 적갈색으로 염색된 형태를 보였으며, 종양부위의 양성판정은 정상조직의 염색강도에 대한 상대적인 염색정도 (relative abundance)에 기초한 반정량적인 평가를 이용하여 정상 상피조직과 동일한 염색강도를 보일 때 +++(강 양성), 주변 기질과는 명확히 구분되나 정상 상피조직보다는 약한 염색강도를 보이는 경우를 ++(중등도 양성), 미약한 염색강도를 보이거나 국소적으로 드물게 염색된 경우를 +(약 양성), 염색이 되지 않는 경우를 -(음성)으로 판정하였다. MMP-2는 정상 상피에서 거의 양성상을 보이지 않았으며 이를 참조하여 정상 상피와 같은 염색정도를 보이면 -(음성), 약간의 염색이 관찰되면 ±(약 양성), 정상 상피에 비해 쉽게 증가된 염색상을 발견할 수 있을 경우를 +(중등도 양성), 현저히 강한 염색강도를 보이는 경우를 ++(강 양성)으로 판정하였다. 두 면역화학조직염색 모두 음성과 약 양성의 염색강도를 보이는 경우를 음성군으로, 중등도 양성과 강 양성으로 나타난 경우를 양성군으로 분류하였다.

통계학적 분석
   통계 분석은 Fisher's exact test와 McNemar's test(with Yates' correction)을 이용하여 종양의 국소병기, 림프절전이, 세포분화도에 따른 E-cadherin과 MMP-2발현과의 관련성을 분석하였다. p값이 0.05이하일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.

결     과

E-cadherin의 면역조직화학적 발현 양상
   E-cadherin은 전체 25예중 13예(52%)에서 약 양성이나 음성발현을 보였다. 국소병기나 조기암에서의 림프절전이 여부에 따른 E-cadherin의 발현정도는 유의한 관련성이 없었다(p>0.05). 그러나 조직학적 분화도에 따른 분류에서 고분화암군의 경우 13예 중 9예, 중등도 및 미분화암군의 경우 12예중 4예에서 E-cadherin의 발현이 감소하여 통계적으로 의미있는 관련성이 있었다(p=0.034)(Table 1, Fig. 1). 

Matrix metalloproteinase-2의 발현 양상
   MMP-2는 전체 25예 중 13예(52%)에서 증가된 발현양상을 보였다. 국소병기에서는 조기암군과 진행암군간에 발현정도의 차이가 없었으나, 림프절전이 면에서는 조기암군 중 N+군에서의 MMP-2의 발현증가가 N0군에 비하여 통계학적으로 의미있는 것으로 나타났다(p=0.045). 조직학적 분화도에 따른 발현양상의 차이는 없었다(p>0.05)(Table 2, Fig. 2).

E-cadherin과 Matrix metalloproteinase-2 발현 양상의 상관관계
   종양세포에서 E-cadherin의 발현이 감소되고 MMP-2의 발현이 증가된 예는 6예(24%), E-cadherin과 MMP-2의 발현이 모두 정상 조직과 유사하게 발현된 경우는 5예(20%)로 나타났으며, 두 물질간에 상호 역관계가 성립하지 않는 예는 14예(56%)로 구강설 편평세포암종에서 E-cadherin의 발현과 MMP-2의 발현사이에는 통계적으로 연관성이 없었다(p>0.05)(Table 3).

고     찰

   두경부 암종중 비교적 높은 빈도를 보이는 설 편평세포암종은 다른 구강암종과 같이 안면부의 손상과 기능적 결손을 초래할 뿐만 아니라 경부림프절로 쉽게 전이되어 예후 또한 좋지 않다. 이는 암세포의 침습성과 관련이 있으며,⁴⁾ 따라서 국소 침윤이나 인접 림프절로의 전이의 정도가 예후를 나타내는 지표로 사용된다. 
   두경부 종양에서는 암세포의 침습성에 최근 desmoglein, CD44H, α5 integrin 등 여러 가지 부착분자에 대한 연구가 진행되어 왔으며 이러한 물질들 중 하나인 cadherin은 120 kD의 막성 당단백질로서, 칼슘이온-의존성의 동종친화성 상호작용으로 세포들을 연결시켜 태생기의 발달과 성인의 조직구조 유지에 주된 역할을 한다.⁵⁾ Cadherin은 조직 분포와 면역학적 특이성에 따라 E-, N-, P-cadherin의 여러 아군(subclass)으로 나누어지는데, 이들은 모두 유사한 분자량 및 칼슘이나 단백분해효소에 대한 민감도를 가지고 있다.⁶⁾ 
   악성 종양의 예후인자로서 E-cadherin에 대한 연구는 활발히 진행되어 위선암, 유방암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 결장직장암 등에서 세포의 분화도, 전이도와 반비례하여 E-cadherin이 발현됨이 관찰되었다. 두경부암종 영역에서는 Bowie 등⁷⁾이나 Downer 등⁸⁾이 분화도와 E-cadherin의 발현과는 통계학적 연관관계가 없다고 보고하였으나, Sorscher 등⁹⁾과 Williams 등¹⁰⁾은 분화도가 낮을수록 E-cadherin의 발현정도가 감소하는 상관관계를 보인다고 하였다. 그 밖에 Schipper 등¹¹⁾이나 Yoo 등¹²⁾은 E-cadherin의 발현이 림프절 전이여부와 연관이 있는 것으로 보고하였다. 
   본 연구에서는 E-cadherin발현 감소가 원발병소의 크기나 림프절 전이여부와 유의한 상관관계가 없었으나, intratumoral heterogeneity를 고려해볼 때 기저막 침습부위의 종양세포에서 그 발현을 평가한다면 실질내로 들어간 암소에서의 발현과 다른 결과를 나타낼 수도 있을 것이라 생각된다. 한편 조직학적 분화도와의 관계에서는 고분화 편평상피암종보다 중등도 및 저분화성 편평상피암종의 경우에 E-cadherin의 발현이 유의하게 높게 나타났다. 이는 분화도가 낮은 종양에서 E-cadherin의 발현이 저하되고 따라서 세포사이의 유착이 와해되면서 상피세포의 침윤성이 증가하는 것으로 생각해 볼 수 있다. 조직학적 분화도의 측면에 대한 Behrens 등²⁾의 연구에 의하면 편평상피세포에 특이적인 조절효소가 E-cadherin 촉진인자에서 발견되었는데, 분화가 잘 되어있는 세포에서는 활성화되어있고, 미분화된 세포에서는 비활성화 되어있는 것으로 보아 E-cadherin의 유전인자 돌연변이나 E-cadherin발현의 간접적인 억제에 의한 것으로도 추정해 볼 수 있다.
   종양세포에 의해 분비되어 세포기질의 단백질을 분해하는 효소중 기저막의 주요성분인 제 4 형 교원질을 분해하는 type IV collagenase에는 MMP계열의 일원으로 MMP-2 (gelatinase 72 kd), MMP-9(gelatinase 92 kd) 등이 있으며, 이들은 제 5 형 교원질과 elastine도 함께 분해시켜 기저막 파괴의 중요한 효소로 알려져 있다.¹³⁾¹⁴⁾ 위선암, 췌장암, 전립선암, 유방암, 난소선암, 자궁내막암, 뇌종양 등에서 MMP-2의 발현이 증가된 경우 주위조직으로의 침윤과 림프절 전이의 빈도가 증가하는 것이 보고되었고, 구강 및 구인두 편평세포암종에서는 Kusukawa 등¹⁵⁾이 원발병소의 MMP-2의 발현이 증가함에 따라 종양침윤 및 전이가 증가함을 면역조직화학적으로 관찰하였으며, Tomokazu 등¹⁶⁾은 두경부암 중에서도 구강설 편평상피암에 대한 연구를 통해 MMP-2의 발현증가가 높은 병기 및 림프절 전이와 연관성이 있음을 보고하였다. 본 연구에서는 진행암의 경우에는 모든 예에서 림프절 전이가 조직학적으로 발견되었기 때문에 림프절 침범 유무에 따른 발현양상의 차이를 분석할 수 없었고, 조기암에서는 림프절 전이가 있는 경우 그렇지 않은 경우에 비해 원발병소에서의 MMP-2의 발현이 증가된 것으로 나타났으나, 종양의 크기나 조직학적 분화도에 따른 발현정도의 차이는 관찰되지 않았다. Kobayash 등¹⁷⁾은 햄스터에서 림프절 전이를 유발시킨뒤 전이림프절에 분포한 종양세포 주위의 기저막에서 제 4 형 교원질이 소실된 것을 관찰하였는데, 이와같이 MMP-2는 종양세포에서 그 발현이 증가하여 변성된 교원질 뿐만 아니라 기저막의 주요 골격을 이루는 제 4 형 교원질을 분해함으로써 림프절 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 상피암종에서의 E-cadherin과 MMP-2의 상호 연관성은 Anzai 등¹⁸⁾이 인간의 위선암종에서 암종의 진행과 림프절 전이에 따른 두 물질간에 서로 역관계(inverse correlation), 즉 진행된 위선암에서 림프절 전이가 있는 경우 MMP-2의 발현이 증가하고 E-cadherin의 발현은 감소한다는 보고를 하였으나 편평상피암종의 경우에는 이러한 연구가 아직 미흡하였고, 저자의 경우에는 구강설 편평상피암종에서 두 물질간의 역관계가 통계학적으로 의의있게 나타나지 않았다.

결     론

   본 연구를 통해 설 편평상피암종에서의 E-cadherin은 종양의 분화도와, MMP-2는 조기암에서의 림프절 전이와 관련되는 객관적인 생화학적 변수(biochemical parameter)로 활용될 수 있는 가능성을 제시한다고 볼 수 있으며, 앞으로 설 편평상피암종의 침윤깊이와의 관계 등에 대한 보다 자세한 연구가 필요하다고 생각된다. 

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