교신저자：손수준, 705-718, 대구광역시 남구 대명 4동 3056-6  대구가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   골수 대식세포에서 유래하는 거대 다핵세포인 파골세포(osteoclast)는 골흡수를 담당하는 주된 세포로서 각종 만성 염증성 질환에서의 국소적인 골파괴에 주요한 역할을 한다.¹⁾ 진주종에서 파골세포의 활동은 특징적인 측두골 파괴로 인한 난청, 현훈, 안면신경마비 혹은 두개내 합병증을 유발하여 종종 응급수술을 필요로 한다.²⁾ 류머티스 관절염에서의 관절변형, 치주염에서의 치조골 소실, 인공관절 주위의 골소실로 인한 재수술 등은 모두 파골세포의 골흡수에 기인한 것이다.³⁾⁴⁾⁵⁾
   각종 염증성 사이토카인, 프로스타글란딘, 신경 펩타이드 등이 이러한 염증성 골파괴질환에서의 파골세포 증식 및 골흡수 기능에 직, 간접적으로 관여한다. 염증성 사이토카인인 Interleukin-1(IL-1), interleukin-6(IL-6), tumor necrosis factor alpha(TNF-α) 등은 파골 전구세포(osteoclast precursor)인 골수 대식세포(bone marrow macrophage)를 염증 장소로 유인하고 파골세포로 분화하도록 자극하며, 분화된 파골세포를 활성화하여 주위골을 흡수하도록 한다고 알려져 있다.⁶⁾⁷⁾ 그러나 이러한 염증성 사이토카인이 골수 대식세포나 파골세포를 직접 자극하는지 아니면 다른 매개세포를 통하여 간접적으로 자극하는지에 대해서는 아직 논란이 있다.
   Substance P(SP)는 통증을 전달하는 신경펩타이드로서 중추 및 말초신경계에 널리 분포한다. SP는 장골, 관절, 치아, 골수 등 골조직의 신경말단에서도 발견되며⁸⁾ 골파괴에 관여한다. 교감신경 절제술은 감각신경을 활성화하여 척수의 SP 및 SP mRNA발현을 증가시키고 골흡수를 야기한다.⁹⁾ Capsaicin투여는 SP의 소실로 인해 감각신경을 마비시키고 실험적으로 유도된 골흡수를 저지한다.¹⁰⁾ SP는 분리된 토끼 파골세포 및 배양된 생쥐 두개골의 칼슘농도를 상승시킨다.¹¹⁾ 최근 SP와 그 수용체가 림프구, 단핵구 및 대식세포 등 염증세포에서 발견되었으며¹²⁾ 이들 세포에서 SP와 그 수용체가 결합하면 세포내의 nuclear factor kappa B(NF-κB)가 활성화되어 이들 세포로부터 염증성 사이토카인의 합성, 분비를 촉진하게 된다.¹³⁾ NF-κB의 활성화는 또한 골수 대식세포가 파골세포로 분화하거나 분화된 파골세포가 활성화되는데에 필수적인 요소이므로¹⁴⁾ 이와 같은 결과는 SP가 염증세포를 자극하여 염증성 사이토카인을 분비케 함으로써 간접적으로 골파괴를 유도할 뿐 아니라 직접적으로 골수 대식세포나 파골세포를 자극할 수 있음을 시사한다. 그러나 파골 전구세포나 파골세포에 대한 SP의 직접적인 효과, 그리고 이들 세포에서의 SP수용체의 발현 여부 등은 아직 밝혀지지 않았다.
   이 연구에서는 SP가 파골세포 성장 및 기능에 미치는 직접적인 영향을 규명하기 위해 분리된 생쥐 대식세포가 파골세포로 분화하는 과정에서 SP를 투여하여 그 반응을 살펴보았고, 분화된 파골세포를 dentin 조각위에 두고 SP를 투여하여 골흡수 면적의 변화를 측정하였으며, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통하여 골수 대식세포 및 파골세포에서 SP 수용체 mRNA의 발현여부를 확인하였다.

재료 및 방법

재  료
   SP, macrophage colony stimulating factor(mCSF), receptor activator for NF-κB ligand(RANKL) 등은 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

세포배양
   4~6주 연령의 C57Bl/6 생쥐 대퇴골 및 경골에서 골수를 채취하여 10% fetal calf serum을 함유한(MEM배지(α10 MEM)에서 37℃하에 24시간동안 배양하였다. 24시간 후 배양용기에 유착되지 않은 세포들을 모아 Ficoll-Hypaque용액에서 원심분리하여 중간층에 모인 골수 대식세포를 조심스럽게 흡입하여 mCSF(10 ng/ml)를 함유한 배지에서 3~5일간 배양하여 사용하였다. 파골세포 배양시에는 48-well 배양용기를 사용하였으며 mCSF(0~10 ng/ml)와 RANKL(0~200 ng/ml)을 함유한 배지 1 ml당 200,000~300,000개의 골수 대식세포를 배양하였다. SP(0~1000 nM)는 배양 첫날부터 투여하였으며 파골세포는 대개 5일째부터 관찰되기 시작하였다. 7일째에 세포를 고정한 후 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)염색 후 광학현미경하에서 디지털카메라로 각 well당 무작위로 4군데의 사진을 찍어서 영상분석 software인 SigmaScan^® Pro version 5.0(SPSS Science, Chicago, IL, USA)을 이용하여 TRAP염색된 면적을 구하였다.

파골세포의 골흡수 면적 측정
   골흡수를 측정하기 위해 먼저 골수 대식세포를 dentin 조각위에 놓고 배양하여 파골세포로 분화하도록 하였다. 파골세포가 관찰되는 배양 5일째부터 SP(0~1000 nM)를 투여하였으며 9일째에 dentin 조각위의 파골세포를 제거한 후 toluidine blue용액을 이용하여 골흡수로 인한 함몰부(pit)를 염색하고 광학현미경하에서 디지털카메라로 각 dentin 조각당 무작위로 4군데의 영상을 얻은 후 SigmaScan^® Pro version 5.0을 이용하여 염색된 면적을 구하였다.

역전사 중합효소 연쇄반응
   골수 대식세포 및 배양된 파골세포에 TRIZOL 용액(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)을 가하여 전체 RNA를 분리한 후 Poly(A)⁺ RNA를 분리하고 이를 역전사시켜 cDNA를 합성하였다. SP와 결합하는 3가지 수용체(NK-1, NK-2, NK-3) mRNA의 발현을 보기 위해 중합효소 연쇄반응을 시행하였으며, 사용된 primer들은 다음과 같다(forward와 reverse, 5' to 3' orientation)；CCA ACA CCT CCA CCA AGA CTT CTG와 GCC ACA GCT GTC ATG GAG TAG AT(NK1, 338 bp fragment), TGC TGG TGG CTG TAA CAG GCA ACG와 TAG AAA CAT TGT GGG GAG GCG AGA GC(NK2, 376 bp), GCA GTC TTC GGA AAC CTC ATC GTT와 GAA ATG TTG CTT GGG ACC TTC TGG(NK3, 441 bp). 이 primer들은 출간된 문헌에서 인용하거나 GenBank에 나타난 염기서열에서 exon의 위치에 따라 직접 디자인하였고(accession numbers；NM_009313 for NK-1, NM_009314 for NK-2, NM_021382 for NK-3), 18s ribosomal RNA primer는 loading control로 사용하였다. 중합효소 연쇄반응의 산물은 전기영동을 거쳐 크기별로 분리되었고, 분리된 DNA band는 direct sequencing을 통해 그 염기서열이 확인되었다. 

통계처리
   실험을 통해 얻어진 data는 SigmaStat^®(SPSS Science)을 이용하여 One-way ANOVA 및 Dunn's multiple comparison으로 통계처리하였으며 α는 0.05로 정하였다.

결     과

   SP의 파골세포 분화에 대한 직접적인 영향을 규명하기 위해 이 연구에서는 골수대식세포를 분리하여 배양하였으며, SP의 작용을 매개할 수 있는 stromal cell 혹은 골모세포(osteoblast)는 배제하였다. mCSF와 RANKL을 함유한 배지에서 배양 5~7일째에 여러 개의 핵을 가지고 TRAP염색에 양성반응을 보이는 파골세포들이 다수 관찰되었으며 그 수 및 면적은 SP(100 nM and 1000 nM)투여시 통계학적으로 유의하게 증가하였다(Fig. 1).
   배양된 파골세포의 골흡수로 인해 생성된 dentin조각 표면의 함몰부의 면적은 SP(0.1 nM and 1 nM) 투여시 유의하게 증가하였다(Fig. 2). 파골세포로부터 분리, 합성된 cDNA는 NK-2 primers(TGC TGG TGG CTG TAA CAG GCA ACG와 TAG AAA CAT TGT GGG GAG GCG AGA GC, 376 bp fragment)와의 중합효소 연쇄반응시 primer에 상응하는 크기의 DNA를 생성하였고 그 염기서열은 direct sequencing을 통하여 GenBank의 그것과 일치함이 확인되었다. 이때 사용된 온도는 95℃ denaturation, 63℃ annealing, 72℃ extension 이었고 30 cycle 동안 증폭하였다(Fig. 3). 파골세포는 NK-1 혹은 NK-3 수용체 mRNA는 발현하지 않았으며 골수 대식세포는 어느 NK 수용체 mRNA도 발현하지 않았다.

고     찰

   골수의 stromal cell, 골모세포(osteoblast), T 림프구 등으로부터 분비되는 mCSF와 RANKL은 골수 대식세포가 파골세포로 분화하는데에 필요한 두 가지 인자이다.¹⁵⁾ 최근에 발견된, 오랫동안 찾아왔던 단백질이며 파골세포의 성장에 가장 중요한 인자인 RANKL은 골수 대식세포 표면의 수용체인 RANK(receptor activator for NF-κB)와 결합하면 세포내의 전사인자(transcription factor)인 NF-κB, c-jun 등을 자극하여 특정 mRNA를 전사하게 함으로써 대식세포가 파골세포로 분화하는데 필요한 단백질을 합성케 한다.¹⁶⁾ 아직 RANKL외에는 파골세포 배양을 가능케 하는 물질이 발견되지 않았으며 골흡수에 관여하는 염증성 사이토카인들이 RANKL을 분비하는 세포를 자극하는지, 혹은 골수 대식세포를 직접 자극하여 파골세포로 분화하게 하는지에 대해서는 논란이 많다. IL-1 등은 주로 stromal cell, 골모세포 등을 자극하여 RANKL을 분비케 하며 TNF-α는 골수 대식세포를 직접 자극하여 NF-κB 와 c-jun을 활성화하나⁶⁾ 그것만으로는 충분치 않으며 소량의 RANKL과 동시투여하였을 때만 파골세포가 배양된다고 한다.⁶⁾ 최근 SP가 림프구, 단핵구 및 대식세포 등 염증세포에서 발견되고 일종의 염증성 사이토카인으로 작용한다는 보고¹²⁾¹³⁾가 있으며 SP가 골파괴에 관여하는 기전에 대해서도 위의 염증성 사이토카인에서와 동일한 의문이 있다. Mori 등¹¹⁾은 SP가 토끼 파골세포의 칼슘농도를 상승시킨다는 보고를 하였으나 파골세포 배양시 stromal cell, 골모세포 등을 완전히 배제하지 못하였으므로 SP의 파골세포에 대한 직접적인 효과라고 보기는 어렵다고 생각된다. 본 연구에서는 골수 대식세포만 분리, 배양하였으며 mCSF나 RANKL을 투여하지 않은 경우에는 파골세포가 전혀 배양되지 않았으므로(data not shown) mCSF나 RANKL을 분비하는 다른 세포들은 완전히 배제되었다고 생각된다. mCSF와 RANKL에 의한 파골세포 배양에서 SP(100 nM, 1000 nM)의 투여는 파골세포의 수와 크기를 유의하게 증가시켰으며 이는 100 nM까지는 SP의 농도가 증가함에 따라 증가되었다. 그러나 1000 nM이상의 SP는 파골세포 고사를 초래하기 시작하였다(data not shown). 골흡수 측정실험에서는 파골세포가 출현하기 시작하는 5일째부터 SP를 투여하였으며 SP(0.1 nM, 1 nM)의 투여는 파골세포에 의한 골흡수 면적을 유의하게 증가시켰다. 파골세포 배양에서보다 훨씬 낮은 농도에서 SP의 효과가 나타난 것은 본 연구에서 확인한 바와 같이 파골세포는 NK-2 수용체를 가지며, 이 수용체는 SP를 투여함에 따라 점차 탈감작(desensitization)되기 때문인 것으로 생각된다. 그러나 SP 단독투여로는 파골세포가 배양되지 않으며, SP는 파골세포에 직접 작용하나 TNF-α와 유사하게 RANKL에 의해 유발된 파골세포 분화를 증폭하는 것으로 생각된다. 향후 SP의 파골세포 분화 혹은 기능에 대한 세포내 신호전달체계를 규명하기 위해서는 SP가 골수 대식세포 혹은 파골세포의 NF-κB, c-jun 등을 활성화하는지에 관한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
   포유동물에서 SP는 neurokinin A(NK-A), neurokinin B (NK-B)와 함께 tachykinin family에 속하며 이들은 preprotachykinin A와 B 유전자의 alternative splicing에 의해 그 mRNA가 합성된다.¹⁷⁾ Tachykinin의 생물학적 효과는 그와 반응하는 3가지의 G protein-coupled receptor인 neurokinin(NK)-1, NK-2, NK-3 수용체와의 반응에 의해 결정된다. 이들 3가지 NK 수용체는 서로 매우 유사한 구조로 되어 있으며 이것은 그 반응기전이 서로 비슷한 것을 의미한다. 실제로 SP, NK-A, 그리고 NK-B는 각각 3가지 NK 수용체 모두와 반응하며 단지 그 친화도가 다를 뿐이라고 한다.¹⁸⁾ 골조직에 대한 면역화학적 연구⁸⁾에서 NK-1 수용체가 파골세포에서 발견되고 SP수용체 차단제가 SP에 의한 골파괴효과를 상쇄한다는 보고¹¹⁾가 있으나 아직 골수 대식세포나 파골세포에서 NK 수용체 유전자의 발현은 보고된 바 없다. 본 연구는 파골세포가 NK-2 수용체 mRNA를 발현함을 보고한다. NK-2 수용체는 tachykinin 중 NK-A와 가장 친화도가 높지만 SP와 NK-A는 대개 같이 합성되고 분비되며, SP 또한 NK-2 수용체에 대한 좋은 결합물질이 된다.¹⁹⁾ 골수 대식세포는 NK-2 수용체 mRNA를 발현하지 않았지만 파골세포로 분화해 가면서 NK-2 수용체를 발현하게 되는 것으로 생각되며 이는 같은 과정에서 mCSF와 RANKL에 대한 수용체가 발현되는 것²⁰⁾과 동일한 기전으로 이해될 수 있다.
   본 연구의 결과를 종합하면 SP는 파골세포 표면의 NK-2 수용체를 통하여 파골세포의 성장과 골흡수를 직접적으로 자극한다고 생각된다. 

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