교신저자：이강대, 602-702 부산광역시 서구 암남동 34번지  고신대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   갑상선 수질암은 상대적으로 발생률이 낮아 전체 갑상선암 중 3~9%를 차지하며 갑상선의 C세포에서 기원한다. 갑상선 수질암의 75%는 산발적으로 발생하며 25%에서 가족력을 가진다.¹⁾ 유전성 갑상선 수질암은 많은 경우에 MEN2A(multiple endocrine neoplasm 2A), 2B의 형태로 발현되지만 갑상선 수질암만 유전되는 경우도 있어 이를 가족성 갑상선 수질암(familial medullary thyroid carcinoma, FMTC)라고 한다.²⁾³⁾
   전통적으로 유전성 갑상선 수질암의 선별검사는 칼슘이나 펜타가스트린에 의해 자극된 calcitonin의 비정상적 상승에 의하여 이루어졌으나 생리적 C세포의 과형성(physiologic C-cell hyperplasia)이 정상인에서도 나타날 수 있고, 메스꺼움, 구토, 발한 등의 부작용을 감수하면서 모든 가족구성원이 매년 반복해야 한다는 점, 그리고 실제로 검사가 필요 없는 50%에서도 시행해야 하는 불편함이 있었다. 이러한 단점을 극복하기 위해 분자생물학적 측면에서 유전성 갑상선 수질암을 진단하기 위한 노력이 이루어지다가 1987년, Mathew 등이 10번 염색체의 pericentric 지역에 gene의 linkage를 시도하였다. 이후 1993년 Mulligan 등⁴⁾⁵⁾에 의해 RET proto-oncogene의 변이가 MEN2A와 FMTC의 유전성 갑상선암에서 발생한다는 사실이 밝혀지면서 국제적으로 RET gene의 유전자적 변이분석(mutation analysis)은 유전성 갑상선 수질암의 선별검사 프로그램에 있어 중요한 검사법으로 빠르게 인정을 받았고 기존의 calcitonin에 의한 생화학적 선별검사의 단점을 극복하고 MEN2A, 2B와 FMTC 가족에 있어 더욱 신뢰할 수 있고 비용면에서 효과적인 검사로 널리 알려지게 되었다. 그리고 무엇보다 이 검사의 핵심은 유전성 갑상선 수질암 보유자들에 대하여 예방적 갑상선 절제술의 시행 유무에 결정적 단서를 제공하고 있다는 것이다.
   본 연구에서는 한명의 지표환자(index patient)의 가족력을 통해 확인된 가족성 갑상선 수질암 가계에서 분자유전학적 방법을 이용하여 RET proto-oncogene의 점돌연변이(point mutation)를 확인하고, 이를 통해 가족 구성원 중에 점돌연변이 보유자의 유무에 대해 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   1998년 11월부터 2003년 3월까지 4년 4개월간 고신대학교 복음병원 이비인후-두경부외과를 방문하여 산발적 갑상선 수질암으로 진단 및 수술을 받은 5명의 환자와, 가족력상 유전성 갑상선 수질암으로 의심되는 1명의 환자에 대하여 DNA 분석(DNA sequencing)을 통해서 MEN과 FMTC에 대한 점돌연변이의 유무에 대해 알아보았다. 이후 지표환자(index patient)를 통해서 확인된 점돌연변이의 결과를 바탕으로 세 세대를 포함한 가족 9명에 대해서 같은 검사를 실시하였다.

임상 검사
   먼저 기본적인 갑상선 수질암의 진단을 위하여 경부 컴퓨터단층촬영, 초음파하에 세침흡입검사를 시행하였으며, 혈청 calcitonin, carcinoembryonic antigen(CEA)를 측정하였다(Table 1). 그리고 동반가능성이 있는 MEN의 검사를 위해 혈청 calcium, 부갑상선 호르몬과 24시간 소변에서 epinephrine, norepinephrine, VMA, metanephrine catecholamine을 검사하였다.

DNA 추출과 PCR을 이용한 증폭
   DNA extractor WB kit(Wako Chemicals, Tokyo, Japan)를 이용하여 citrate 또는 EDTA ant-icoagulated peripheral lymphocyte로부터 genomic DNA를 추출하고, RET gene의 exon 10, 11, 13, 14, 15, 16를 포함하는 oligonucleotide primer를 DNA synthesizer model 8700(Biosearch, San Rafael, CA, USA)을 이용하여 DNA를 증폭하였다(Table 2).
   PCR 증폭반응은 100 ng template DNA, 1.0 또는 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTPs, 각각의 sense, antisense primer 5 pmol, 1 unit의 Taq polym-erase(Amersham, Tokyo, Japan)의 농도로 구성된 완충액에 넣어서 총 50 μl의 반응액을 PC-700 programe thermal cycler(Astec, Tokyo, Japan)를 이용하여 시행하였다. 열변성을 위해 94℃에서 3분 반응시키고 94℃에서 30초(denaturation), 55℃에서 30초(annealing), 72℃에서 1분간 polymerase 반응을 35주기 후 72℃에서 7분(final extension)으로 분절을 증폭시켰다. 모든 PCR 반응은 반복적으로 시행함으로써 RET mutation의 존재유무 판정에 신빙성을 검증하였다.

Nonisotopic Single-strand Conformation Polymorphism(SSCP) analysis and sequencing
   PCR 산물은 96% formamide, 20 mM EDTA, 0.05% bromophenol blue, 0.05% xylene cyanol로 구성된 용액에 희석하였다. 이 희석된 용액 20 μl sample은 85℃에서 3분 동안 변성했고 10% formamide와 함께 30 W로 3~5시간 동안 전기영동을 시행하였다. 전기영동 후 DNA는 silver staining 방법으로 확인하였다. gel은 10% trichloroacetic acid로 20분간 고정하고 이후 실온에서 10분간 50% methanol로 고정하였다. 그 다음 gel은 5분간 증류수로 세척하고 15분간 10% silver staining 용액에 배양하였다. 증류수로 세번 세척한 후 5% 현상액에서 현상하고 10분간 현상정착액(stop solution)에서 세척한 후 탈이온화된 용액으로 역시 5분씩 3회 세척하였다. gel은 gel 드라이를 이용하여 여과지를 통해 건조시켰다. Wild type RET gene band와는 달리 변동성 전이(mobility shifts)를 보이는 mutant-type RET gene band는 육안으로 확인이 가능하였다.

결     과

DNA sequence
   6명의 MTC 환자 중에서 MEN군을 위한 검사에서는 모두 정상적인 소견을 보여 MEN을 배제할 수 있었다. 산발적 갑상선 수질암으로 추정되었던 5명의 환자의 DNA sequencing에서는 점돌연변이를 나타내지 않아 유전성이 아님을 확인하였고(wild type)(Fig. 1A), 가족력상(pedigree)(Fig. 2) 유전성 갑상선 수질암으로 추정되었던 1명의 지표환자는 자동염기서열 분석법으로 RET proto-oncogene exon 10의 codon 618에서 TGC(cyc)에서 CGC(Arg)로의 점돌연변이를 확인하였다(mutant type)(Fig. 1B).
   그리고 그 가족들의 구성원 9명 중 4명(조모, 친모, 삼촌, 삼촌의 딸)에서 지표환자와 같은 germline point mutation을 발견하였다. 그리고 4명 이상의 환자에서 MEN을 동반하지 않아 familial medullary thyroid carcinoma로 확정 진단하였다(Figs. 3 and 4).

수술적 치료 및 술 후 추적관찰
   FMTC로 진단된 지표환자는 경부단층촬영상 우측 갑상선이 4×4 cm 정도로 종대 되어 있고, 그의 모친은 석회화된 병변과 더불어 양측 경부로 다발성 전이를 보이고 있었다. 재발방지를 위해 두 환자에 대해 매우 세심한 수술을 하였는데 지표환자는 갑상선 전절제술과 양측 변형 경부청소술 III형, 중앙경부 청소술, 모친은 갑상선 전절제술과 양측 변형 경부청소술(우측 mRND I, 좌측 mRND II), 중앙경부청소술을 시행하였다. 술 후 추적 관찰에서 지표환자에 있어서는 현재 11개월 동안 임상적, 생화학적 재발의 증거가 없지만, 그의 모친은 같은 기간동안 calcitonin치가 735 pg/ml로 현미경학적 또는 잠재전이의 가능성을 시사하여 방사선학적 검사를 시행할 예정이다. 조모는 고령으로 인하여 수술을 거부하였고 임상발현 전 유전자 보유자(presymptomatic carrier)인 그의 삼촌과 그의 딸에 대해서는 전반적인 검사 후 예방적 갑상선 전적출술을 시행할 예정이다.

고     찰

   갑상선 수질암의 예후는 미분화암 보다 양호하지만, 평균 5년 생존률은 72%, 10년 생존률 56% 정도에 그치고 있는 실정이다.⁶⁾ 이러한 예후에 영향을 미치는 요소로는 초기 진단시의 나이, 림프절전이, 원격전이, 병기 등이 중요한데 갑상선 수질암의 치료 후 완치를 기대하기 위해서는 무엇보다 암의 임상적, 생화학적 발현이 일어나기 전에 조기에 진단하여 치료하는 것이 핵심이다.⁶⁾ 따라서 임상발현전 유전자 보유자를 미리 알아내는 방법 즉, 기저막을 침범하는 MTC보다 C세포 과형성 이전의 단계에서 진단과 치료가 이루어지면 보다 근치적인 측면에서 접근할 수 있을 것이다. 물론 기존의 칼슘이나 펜타가스트린을 이용한 calcitonin의 자극검사로 C세포 과형성 이전 단계에서 진단을 할 수 있지만 사용되는 분석 방법의 민감도와 특이도에 따 라 그 신뢰성이 다양하여 위양성, 위음성 등의 실험실 오류가 나타날 수 있다. 실제로 위양성으로 인해 calcitonin 자극검사의 위험그룹 중 5~10%의 환자가 갑상선 전절제술 후 유전자 분석에서 음성으로 나왔다는 보고가 있다.⁷⁾ 또한 Wells와 Lips 등⁸⁾은 정상 calcitonin 수치를 보이는 갑상선 수질암의 유전적 보유자들에 대해 수술을 시행했는데 각각 6명, 14명에서 C세포의 과형성과 MTC의 조직검사 결과를 보이는 위음성의 결과에 대해 보고하여 calcitonin치에 근거한 수술의 결정에 오류가 있을 수 있음을 지적하였다. 그리고 점돌연변이를 보유하고 있을 유전자 보유자들에게 45세까지 매년 검사를 해야하고, 실제로 검사가 필요없는 비보유자 50%의 가족군에 대해서도 매년 검사를 해야하기 때문에 모든 환자군에 대하여 정기적인 검사를 시행하는데 어려움이 따른다. 이러한 calcitonin 자극검사의 단점을 극복하기 위한 생물학적 연구가 진행되다가 1980년대 후반에 MEN2A의 근본적 원인 gene이 linkage analysis에 의해 chromosome 10q11.2에 위치하고 있다는 사실이 밝혀지게 되었다.^9)10)11)12)
   RET gene protein은 receptor tyrosine kinase 군의 일환이며 세포의 성장과 분화를 위한 신호를 전달하는 세포 표면 glycoprotein의 수용체이다.¹³⁾ 1993년 Mulligan 등¹⁴⁾은 MEN2A, B 및 FMTC와 연관된 RET proto-oncogene의 점돌연변이가 RET의 exon 10과 11에 존재함을 밝혀냈다. 이 변이는 다섯개의 cysteine residues 중 하나에서 nonconservative substitution을 통하여 RET 단백의 산물에 "gain of function"을 일으키고, 내인적 tyrosine kinase의 활성증가를 통하여 기질 인식(substrate recognition)과 변형 능력(transforming capability)에 이상을 일으킴으로써 종양성 병변을 야기함이 알려졌다. 이에 기초한 유전성 갑상선 수질암 환자에 대한 RET gene 변이의 DNA 분석은 매우 신뢰성 있는 방법으로 받아들여지고 있다. Frank 등¹⁵⁾의 보고에 의하면 35 가족 중 34 가족에서 RET gene의 점돌연변이를 발견했고 이 가족들에 대해서 DNA 분석의 위양성이나 위음성은 없는 것으로 보고 하였다. 또한 Mulligan 등⁴⁾은 MEN2와 FMTC의 118 가족을 대상으로 MEN2A의 97%, FMTC의 86%에서 점돌연변이를 발견하였다. 실제로, MEN2A 가족의 95% 이상에서 RET gene의 점돌연변이를 가지고 있으며 이는 exon 10의 codon 609, 611, 618, 620, exon 11의 codon 634의 다섯 개의 cysteine codon에 집중되어 있다(Table 3).
  International RET Mutation Consortium에서도 총 203 MEN2A families 중 199(98%)에서 이들 다섯 개의 cysteine codons에서 점돌연변이가 발생했음을 보고하였다.¹⁶⁾ 이 다섯개의 cysteine codon 중 codon 634가 가장 흔히 침범되며(MEN2A 가족의 85%) TGC에서 CGC로의 치환(52%)이 가장 흔한 것으로 알려져 있다. 
   FMTC 가족에서 germline RET mutation 발생확률은 MEN2A 보다는 다소 낮지만 약 88% 이상 발생하고, 이의 변이는 codon 630에서도 부분적으로 일어나지만 대부분 MEN2A와 같은 다섯 개의 cysteine codon에서 발생한다.¹⁷⁾ 본 연구의 증례에서도 exon 10의 codon 618에서 TGC(Cys)이 CGC(Arg)으로 치환됨을 보여주고 있다. MEN2B 가족에서는 거의 95%에서 codon 918에 점돌연변이를 가지고 있다.
   본 연구의 증례는 전경부 종물을 주소로 내원한 24세의 지표환자를 통해서 이루어졌다. 세침흡입 검사에서 갑상선 수질암의 결과가 나왔고, 수술 전 calcitonin 치는 1026 pg/ml였다. 가족력 상 환자의 모친과 조모가 전경부 종물과 양측 경부의 전이성 종물이 촉지되었고, 이모는 전경부의 종물과 간의 원격전이, 증조모 또한 광범위한 전경부, 측경부의 종물로 사망한 가족력을 가지고 있었다. 그리하여 가족성 갑상선 수질암을 의심하게 되었고 먼저 지표환자에 갈색세포종에 대한 선별검사와, 부갑상선 호르몬치 측정을 시행하여 MEN2A를, 입술, 혀의 neuroma나 골격계의 이상소견이 없어 MEN2B를 배제하였다. 이로 일단 가족성 갑상선 수질암으로 추정하였는데, 이 시점에서 확정 진단을 보류한 이유는 FMTC의 정의상 한 가족에 4증례 이상의 병력이 있어야 추후 발견될 수 있는 MEN2 class의 질병을 배제하고 순수한 FMTC로 확정할 수 있기 때문이다. 그 후 지표환자의 가족들에 대한 genetic counselling을 통해서 가족성 갑상선 수질암에 대한 교육을 시행하고 지표환자를 포함한 총 10명에 대한 DNA 분석을 시행하였다. 지표환자는 exon 10의 codon 618에서 TGC가 CGC로 치환되는 germline point mutation을 보였고, 그의 모친, 조모, 삼촌, 삼촌의 딸에게서 지표환자와 같은 점돌연변이를 나타냈다. 이의 결과를 바탕으로 총 10명의 가족 중 5명에서 양성을 나타내어 50%의 양성률, 그리고 4증례 이상에서 수질암이 발생하여 FMTC로 확정 진단하게 되었다. 하지만 Kim 등¹⁸⁾의 보고에 의하면 codon 618번과 620번의 돌연변이에서는 FMTC로 추적관찰 되다가 드물게 갈색세포종이 나타나는 경우가 있어 경한 경과를 보이는 MEN2A로 추후 판명될 수 있다. 이로 인해 본 증례의 연구에서도 장기간 추적관찰을 하다가 우연히 갈색세포종이 나올 수 있으므로, 분명한 RET gene의 점돌연변이가 존재하더라도 추적관찰에 있어 다른 내분비적 질환에 대한 선별검사가 반드시 필요하다.¹³⁾
   반면, codon 634의 변이는 갈색세포종, 부갑상선기능항진증과 연관되어 나타나는 경우가 많아 codon 618, 620에 비해 중한 임상경과를 나타내고 International RET mutation Consortium에서¹⁶⁾ MEN2A의 85%가 codon 634의 mutation에서 비롯되었으며, 순수한 FMTC에서는 불과 30%에서 나타나는 것으로 보고 하였다.
   MEN, FMTC의 RET proto-oncogene 변이의 존재는 수술에 있어 새로운 paradigm이라고 볼 수 있는데 이는 수술에 관한 결정이 환자 DNA의 RET proto-oncogene의 점돌연변이의 발견에 의해 결정되는 것이다. Lips 등¹³⁾은 임상발현 전 유전자 보유자를 세가지 위험 그룹으로 나누었는데 highest risk group은 MEN2B children 그룹으로 codon 883, 918, 922에서 RET mutation을 보이는 경우라고 분류했고, MTC의 조기 발현으로 인해 유아기(infancy)때 갑상선 전절제술과 중앙경부 청소술을 시행해야 한다고 하였다. second highest risk group은 codon 611, 618, 620, 634, 또는 891의 변이이며 6세 이전에 갑상선 전절제술과 중앙경부 청소술을 권장했으며 low risk group은 codon 609, 768, 790, 791, 804의 mutation이며, 수술 시기는 펜타가스트린 자극검사에서 이상이 나타나는 early adulthood의 시기에 시행한다고 보고하였다. 이들은 정상 calcitonin 수치의 유전자 분석에 의해 MEN2A 보유자로 밝혀진 14명의 어린 환자 중 8명에 대하여 갑상선 절제술을 시행했는데 모두에서 MTC의 foci가 발견되었다.¹⁹⁾
   Skinner 등²⁰⁾도 MEN2A와 MEN2B의 49명 어린이들 중 14명에 대한 유전자분석에 기초 하여 예방적 갑상선 절제술을 시행하였으며 이들의 평균 나이는 10.5세, 술 후 calcitonin치는 모두 정상이었으며 평균 추적 관찰기간 1.3년 동안 재발한 수질암은 없다고 보고하였다. 본 증례에서 지표환자의 모친처럼 고령과 임상적 발현 이후의 수술은 술 후 잠복 전이에 따른 지속적인 고칼시토닌혈증(hypercalcitoninemia)와 인접전이(locoregional) 및 원격 전이의 위험이 있어 좋은 예후를 기대하기 어렵다. 또한 지표환자의 삼촌의 딸에서도 같은 exon 10의 codon 618에서 TGC가 CGC로 치환되는 점돌연변이를 나타났는데, FMTC에서 정상 calcitonin치가 C세포 자극 검사에서 상승 반전할 수 있는 나이가 18~31세(평균 23세), MEN2 가족에서는 6~33세(평균 16세)인 것을¹³⁾ 감안한다면, 이 어린 유전자 보유자의 나이는 14세로 이미 C세포의 과형성, 또는 그 이상의 조직학적 변화와 calcitonin 자극검사치가 상승해 있을 가능성이 있어 예방적 갑상선 적출술이 필요할 것으로 판단되며 개인적 사정으로 인해 수술이 연기되고 있지만 조만간 수술을 시행할 예정에 있다.
   유전성 갑상선 수질암 가계의 임상발현 전 유전자 보유자의 선별검사로서 DNA 분석효과에 대해 여러 연구에서 보고하고 있고, 본 증례에서도 알 수 있듯이 유전적 보유자의 조기발견을 통한 근치적 접근을 가능하게 한다. 또한, 본 연구의 FMTC 가계 뿐만 아니라 국내의 다른 MEN2와 FMTC 가계의 정보를 종합하여 우리나라에서 흔한 돌연변이의 형태를 정리하고, 그에 관한 genetic counselling의 체계 및 유전자 분석에 대한 보편적 인식이 자리를 잡고, 적절한 수술시기 등에 대하여 평가하는 작업이 이루어 진다면 유전성 갑상선 수질암에 대한 근치적인 접근이 가능할 것이다.

결     론

   지표환자에서 자동염기서열 분석법으로 RET proto-oncogene, exon 10의 codon 618에서 TGC(Cys) CGC(Arg)로의 점돌연변이를 확인하였고 그 가족들의 구성원 9명 중 4명에서 같은 점돌연변이를 발견하였다. 그 중 생 화학적, 임상적 증상이 있는 지표환자와 한 명의 가족에서 갑상선 전적출술과 경부절제술을 시행한 후 현재 추적 관찰중이며, 나머지 2명의 유전자 보유자들에 대해서도 추후 수술이 예정되어 있다. 이러한 유전분석을 통하여 유전성을 지니는 갑상선 수질암 환자의 구성원에서 점돌연변이 보유여부에 대하여 선별검사를 실시함으로써 기존의 calcitonin 자극검사의 단점을 극복 할 수 있고 조기진단을 통해 보다 근치적인 접근을 할 수 있을 것으로 사료된다.

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