교신저자：나기상, 301-721 대전광역시 중구 대사동 640  충남대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   오존은 광화학 스모그의 주된 성분으로 사람이나 동물이 오존에 노출되었을 때 상피투과성 증가, 혈관투과성 증가, 점액의 과분비 등 기도점막의 염증성 변화와 상피세포의 손상, 편평상피 화생, 배세포의 증가 등 형태학적 변화를 초래하며,¹⁾²⁾ 알레르기 비염이나 기관지 천식 등에서는 항원에 대한 기도의 반응성이 증가한다고 알려져 있다.³⁾⁴⁾⁵⁾ 오존에 의한 염증반응과 세포 손상의 기전은 아직 확실치 않지만 오존에 의한 세포 지질이나 단백질의 직접적인 손상과 함께 오존에 의해 생성되는 여러 세포독성 물질에 의해서도 유발된다고 알려져 있다.
   산화질소(nitric oxide, NO)는 중요한 세포독성 매개체로 기도점막의 여러 세포에서 산화질소 합성효소(NO synthase, NOS)에 의해 생산된다. NOS의 여러형태 중 유발형 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)는 기도염증반응을 일으킬 수 있는 여러 자극에 의해 유발되는데, 오존도 iNOS의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있어 iNOS에 의해 생산된 NO가 오존에 의한 기도점막의 염증과 손상에 중요한 역할을 할 것이라 생각되고 있다.⁶⁾⁷⁾ 그러나 최근에는 NO에 의한 직접적인 손상보다는 NO와 과산소(superoxide)의 반응으로 생성되는 peroxynitrite(ONOO^-)가 세포에 더 큰 손상을 입히는 것으로 보고되고 있다.⁸⁾ peroxynitrite는 세포의 DNA를 분열시키고, 미토콘드리아에서 전해질 이동을 저해시키고 칼슘을 유출시켜 세포에서의 에너지 생산을 방해하여 세포 괴사를 초래할 수 있는 것으로 알려져 있다.⁹⁾
   정상 점막에는 superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase 등의 항산화효소가 있어 산소유리기에 의한 손상을 어느 정도 방어할 수 있지만 많은 양의 산소유리기를 처리하기에는 역부족이다. seleno-organic compound인 ebselen{2-phenyl-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one}은 H₂O₂와 반응하여 독성을 감소시키는 glutathione peroxidase와 유사한 기능을 가지고 있으며, 세포 지질의 과산화를 억제하는 항산화제로 작용할 수 있고,¹⁰⁾ 5-lipoxygenase, cyclooxygenase, NADPH-oxidase, protein kinase 등의 효소를 억제하며,¹¹⁾ NO의 합성을 억제하고,¹²⁾ 강력한 peroxynitrite scavenger로 작용한다고 알려져 있어¹³⁾ NO, 과산소, peroxynitrite 등에 의한 조직 손상을 방어할 수 있을 것이라 기대되고 있다.
   실제로 ebselen은 심근경색¹⁴⁾이나 뇌졸중¹⁵⁾에서 큰 부작용이 없이 조직의 손상을 줄일 수 있는 약제로 알려져 있으며, 최근에는 산소유리기와 peroxynitrite에 의한 기도점막 손상의 예방에도 ebselen이 효과가 있다고 보고되고 있다. Ishii 등¹⁶⁾은 2 ppm의 오존에 4시간 노출된 Sprague-Dawley rat에서 ebselen을 투여하였을 때 ebselen을 투여하지 않은 군에 비해 기관지폐포세정액 내의 알부민 농도와 호중구의 수가 감소하였다고 하였다. 또 Zhang 등¹⁴⁾은 기니픽을 이용한 천식모델에서 ebselen을 투여하였을 때 지연형 과민반응과 기관지폐포세정액 내의 염증세포 수가 감소하였으며 기관지점막의 혈관내피세포에서 iNOS와 nitrotyrosine의 발현이 감소하였다고 보고하였다. 그러나 이들 연구는 폐포나 기관지 점막을 대상으로 한 것으로 비점막의 염증질환에서도 ebselen을 투여하였을 때 같은 효과를 보이는지는 아직 알려져 있지 않다.
   본 연구에서 저자들은 오존노출에 의해 유발된 마우스 비점막의 염증반응에 있어서 ebselen을 투여하였을 때 하기도에서와 같이 염증 정도가 완화될 수 있는지 알아보기 위하여 Evans blue를 이용한 비점막의 혈관투과성을 측정하고 비세정액 내의 알부민 농도와 호중구의 수를 측정하여 비교하였으며, 비점막에서도 ebselen을 투여한 군에서 NO의 생산에 관여하는 i-NOS와 peroxynitrite 활성도의 지표인 nitrotyrosine의 발현이 감소하는지 알아보고자 면역조직화학염색을 실시하였다.

대상 및 방법

실험동물
   무균상태로 사육된 18~22 g의 6주령 BALB/c 마우스 36마리를 사용하였고, 상기도 감염의 증상이나 다른 질환이 관찰되는 마우스는 실험에서 제외하였다. 실험동물은 대조군, 오존노출군, 오존노출+ebselen 투여군으로 나누어 각 군마다 12마리씩 배정하였다.

Ebselen 용액의 제작과 투여
   Ebselen(Sigma, St. Louis, MO) 10 mg을 1 mL dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹이고, 1 mL 생리 식염수를 첨가하여 ebselen 용액을 만들었다. ebselen 투여군에서는 3일간 오존 노출 1시간 전과 노출 3시간 후에 ebselen 용액(32.5 mg/kg)을 복강 내에 주사하였으며 기타 군에서는 용매만이 포함된 용액을 주사하였다.

오존 폭로
   오존 폭로상자는 전신흡입상자(whole-body inhalation chamber)의 형태로 30×20×17 cm 크기로 제작하였다. 오존발생기는 Prince ozone generator(삼성 매직 오존, Korea)를 사용하였으며 발생된 오존은 10 L/min의 의료용 공기(medical air)와 섞여 상자 내로 유입되도록 하였다. Porta-sens model B16-14(Analytical Technology, Oaks, PA)를 이용하여 상자 내의 오존 농도를 측정해가며 오존의 유입량을 조절하여 1.0 ppm으로 농도를 맞춘 다음 폭로 시간 내내 같은 농도가 유지되도록 감시하였다. 그리고 배출구로 나오는 오존은 활성탄을 통하도록 하여 정화한 다음 배출되도록 하였다.
   오존노출군과 오존노출+ebselen 투여군은 1.0 ppm의 오존에 하루 8시간씩 3일간 노출하였으며 대조군은 같은 시간에 의료용 공기를 흡입하도록 하였다.

Evans blue를 이용한 혈관투과성 측정
   마지막 오존 폭로 18시간 후 각 군에서 6마리를 선정하여 Evans blue를 이용한 혈관투과성을 측정하였다. 케타민(250 mg/kg)을 복강 내에 주입하여 마취한 다음, 꼬리정맥을 통해 PBS(phosphate buffered saline)에 용해한 Evans blue(Sigma, St. Louis, MO) 용액(30 mg/kg)을 5초 이상에 걸쳐 천천히 주입하였다. 5분 후 좌심실을 경유하여 대동맥에 도관을 삽입하고 생리 식염수 10 mL로 관류하였다. 관류 후 비강을 개방하고 비점막을 얻어 거즈로 조직의 수분을 제거하고 무게를 측정한 다음 37℃에서 0.2 mL formamide 용액에 18시간 동안 배양하여 조직내의 Evans blue를 추출하였다. spectrophotometer(DU-650, Beckman, Fullerton, CA)를 이용하여 620 nm에서 OD(optic density)를 측정한 다음 Evans blue의 표준곡선(0.01~10 μg/ ml in formamide)을 이용하여 추출된 Evans blue의 농도를 계산하였고, 이미 측정한 조직의 무게로 나누어 단위조직 당 Evans blue의 양을 계산하였다.

비세정액의 채취
   마지막 오존 폭로 18시간 후 각 군의 나머지 6마리에서는 비세정액을 채취하였다. 케타민(250 mg/kg)을 복강 내에 주입하여 마취한 다음 머리를 신전하여 전비공이 가장 낮게 위치하도록 하였다. 기관절개를 하고 기관절개창을 통해 cut-down tube를 삽입하여 관의 끝을 후비공에 위치한 다음 0.1 M PBS 용액 1 mL를 5분 이상에 걸쳐 점적한 다음 전비공으로 흘러나오는 비세정액을 받았다. 비세정액은 평균 0.9 mL가 회수되었다.
   세정액은 원심분리(100 g, 5분)한 다음 알부민 농도를 측정하기 위하여 상청액 0.5 mL을 채취하여 냉동보관하였고 나머지 세정액은 세포 수를 측정하는데 이용하였다. 세정액 내의 알부민 농도는 bromcresol green과의 색반응(color reaction)을 이용하여 측정하였다. 보관하였던 상청액을 bromcresol green(Sigma, St. Louis, MO)과 반응시킨 다음 Spectrophotometer(DU-530, Beckman, Fullerton, CA)를 이용하여 615 nm에서 OD(optic density)를 측정하고 bromcresol green의 표준곡선(0.01~20 mg/dL)을 이용하여 알부민의 농도를 계산하였다.
   남은 비세정액은 호중구의 수를 측정하는데 이용되었다. cytospin(Shandon Cytospin 4, Thermo, UK)을 이용하여 slide glass 위의 5 mm의 직경을 갖는 원 안에 세포들이 고르게 분포하도록 한 다음 Hematoxylin & eosin 염색을 하였다. 400배의 현미경 하에서 무작위로 5시야를 선정하여 호중구의 수를 세고 평균을 낸 다음, 전체 원의 면적과 한 시야의 면적의 비를 구하여 곱함으로써 비세정액 내의 총 호중구 수를 구하였다.

면역조직화학염색
   비점막 내에서 iNOS와 peroxynitrite의 발현 여부를 알아보기 위하여 iNOS와 nitrotyrosine에 대한 면역조직화학염색을 실시하였다. peroxynitrite는 단백질의 tyrosine기를 질화하여 3-nitrotyrosine으로 변화시키기 때문에 nitrotyrosine에 대한 면역염색을 시행하면 peroxynitrite의 존재 및 활성도를 간접적으로 알 수 있다.⁹⁾
   비세정액을 얻은 다음 개흉하여 좌심실을 통해 0.1 M PBS 용액으로 관류한 후 4% paraformaldehyde 용액으로 관류고정하였다. 머리를 잘라 하악과 주위의 피부 및 근육을 제거한 다음 전체 비강을 포함한 블록을 채취하여 같은 고정액에 넣어 실온에서 12시간 동안 후고정하였다. 고정 후 실온의 250 mM ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA) 용액에 7일간 넣어 탈회하였으며 파라핀에 포매한 다음 5 μm 두께의 절편을 만들었다.
   탈파라핀 후 절편을 citrate buffer(pH 6.0) 용액에 담근 다음 5분씩 2회에 걸쳐 microwave에 넣어 가열하였다. microwave에서 처리 후 0.1 M PBS 용액으로 세정하고 내인성 peroxidase의 활성을 저지하기 위하여 0.5% periodic acid 용액에 10분간 반응시킨 다음 다시 PBS 용액으로 세정하였다. 세정이 끝난 다음 ABC kit(Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA) 내에 들어있는 blocking serum(normal goat serum)을 1시간 동안 반응시킨 후 일차 항체로 각각 1：200으로 희석한 rabbit anti-mouse iNOS(Transduction Laboratories, Lexington, KY) 항체와 1：500으로 희석한 rabbit anti-mouse nitrotyrosine(Upstate Biotechnology Co., Lake Placid, NY) 항체를 적하한 다음 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 다음 날 PBS 용액으로 세정 후 이차 항체로 biotinylated anti-rabbit IgG에 1시간 동안 반응시켰다. 다시 PBS 용액으로 세정 후 streptavidin-biotin-peroxidase complex 용액에 1시간 반응시킨 다음 PBS 용액으로 세정하고 0.03% H₂O₂를 포함하는 3',3'-diaminobenzidine 용액을 이용하여 발색하였으며 hematoxylin으로 핵염색을 하였다.

자료 분석 및 통계처리 방법
   각 군 사이에 유의한 차이가 있는지를 알아보기 위하여 SPSS version 10.0의 분산 분석(one way-ANOVA)을 이용하였고, 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결     과

비점막 내로 유출된 Evans blue의 양
   비점막 내로 유출된 Evans Blue의 양은 대조군에서는 64.71±6.45 ng/mg of wet tissue, 오존노출군에서는 119.63±51.60 ng/mg, 오존노출+ebselen 투여군에서는 70.09±15.16 ng/mg으로 오존노출군에서는 대조군에 비해 유의하게 증가되어 있었으나(p=0.035), 오존노출+ebselen 투여군은 대조군과 차이를 보이지 않았으며 오존노출군에 비해 유의하게 감소되어 있었다(p=0.047)(Fig. 1).

비세정액 내의 알부민 농도
   비세정액 내의 알부민 농도는 대조군에서는 6.84±15.29 μg/mL, 오존노출군에서는 60.26±93.49 μg/mL, 오존노출+ebselen 투여군에서는 26.30±59.82 μg/mL로 대조군에 비해 오존노출군에서 증가된 경향을 보였으며(p=0.408), 오존노출+ebselen 투여군에서는 오존노출군에 비해 약간 감소하는 경향을 보였으나 그 차는 통계적으로 유의하지 않았다(p=0.661)(Fig. 2).

비세정액 내의 호중구 수
   비세정액 내의 호중구 수는 대조군에서는 2.31±1.56×10³개, 오존노출군에서는 139.31±59.89×10³개, 오존노출+ebselen 투여군에서는 64.04±51.51×10³개로 대조군에 비해 오존노출군에서 유의하게 증가되어 있었으며(p=0.001), 오존노출+ebselen 투여군에서는 오존노출군에 비해 유의하게 감소되어 있었다(p=0.044). 그리고 대조군에 비해 오존노출+ebselen 투여군에서 호중구가 증가한 경향을 보였으나 그 차는 통계학적으로 유의하지 않았다(p=0.087)(Fig. 3).

비점막에서 iNOS의 발현
   대조군의 비점막은 섬모가 있는 위중층원주상피로 덮여 있었으며 점막하에는 작은 혈관들과 분비선이 관찰되었다. 오존노출군에서는 상피세포에서 섬모가 소실되고 입방형이나 편평상피 모양으로 변하였고 점막하 고유층에는 많은 수의 염증세포 침윤이 관찰되었다. 오존노출+ebselen 투여군에서는 일부 상피층에서 섬모가 소실되어 있었으며 오존노출군에 비해 염증세포이 침윤이 적었다.
   iNOS에 대한 면역반응은 대조군에서는 거의 관찰할 수 없었으나 오존노출군에서는 강한 양성을 보였으며 주로 점막하 고유층에 침윤된 염증세포에서 발현되었고 상피층에서도 약한 양성 반응을 보였다. 그러나 오존노출+ebselen 투여군에서는 iNOS의 발현이 현저히 감소되어 있었다(Fig. 4).

비점막에서 nitrotyrosine의 발현
   대조군에서는 nitrotyrosine에 대한 면역반응을 거의 관찰할 수 없었으나 오존노출군에서는 상피세포, 점막하분비선 등에서 강하게 발현되었고 오존노출+ebselen 투여군에서는 오존노출군에 비해서는 현저하게 감소되어 점막하분비선과 일부 상피세포에서만 약하게 발현되었다(Fig. 5).

고     찰

   기도점막을 자극하는 물질에 노출되었을 때 상피세포의 손상, 혈관투과성 증가, 기도 과민성 증가 등의 염증성 변화가 초래된다고 알려져 왔으나, 그 기전은 아직 불분명하다. 그러나 최근 NO와 peroxynitrite 등의 NO 반응물질이 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. 기도점막이 외부의 자극에 노출되면 TNF-α, IFN-γ 등의 cytokine이 매개체로 작용하여 호중구, 대식세포 등의 염증세포나 혈관내피세포 등에서 NO와 과산소를 분비하고 이어서 peroxinitrite가 생산된다.⁹⁾ peroxynitrite는 단백질의 tyrosine기를 질소화하고 sulfahydryl기를 산화하며 세포막 지질의 과산화, DNA의 분열, 미토콘드리아에서의 에너지 생산을 방해하는 등 세포손상에 결정적인 역할을 한다고 알려져 있다.⁹⁾¹⁷⁾
   기도 표면에는 mucin, albumin, ascorbic acid, reduced glutathione, urate 등의 항산화물질이 존재하여 초기 방어를 담당하고 있는 것으로 알려져 있으나,¹⁸⁾ 강한 외부 자극에 의한 기도점막의 손상을 예방하기에는 역부족이다. 따라서 보다 강력한 항산화물질을 투여하는 것이 예방 및 치료에 필요할 것으로 생각하나 아직 뚜렷한 효과를 보이는 물질은 개발되어 있지 않다. 최근에 개발된 ebselen은 seleno-organic compound로 여러 실험을 통해 항산화작용 및 항염증작용을 가지고 있음이 증명되었으며, 최근 이러한 연구 결과를 바탕으로 동물 모델을 이용한 심근경색,¹⁴⁾ 폐의 염증성 질환,¹⁹⁾ 천식¹¹⁾ 등에서, 그리고 사람의 뇌졸중¹⁵⁾에서 ebselen이 좋은 치료효과를 보였다고 보고되어 있다.
   본 연구에서는 오존노출에 의해 야기된 마우스 비점막의 염증반응을 ebselen을 투여하였을 때 완화할 수 있는지 알아보기 위하여 Evans blue를 이용한 비점막의 혈관투과성을 측정하고 비세정액 내의 알부민 농도와 호중구의 수를 측정하여 비교하였다.
   그 결과 비점막 내로 유출된 Evans blue의 양은 대조군에 비해 오존노출군에서 유의한 증가를 보였고, 오존노출+ ebselen 투여군에서는 오존노출군에 비해 유의하게 감소함을 보여 오존노출 후 발생하는 혈장유출을 ebselen이 효과적으로 차단할 수 있음을 알 수 있었으며, 오존노출+ebselen 투여군은 대조군과 별 차이를 보이지 않아 오존노출 후 나타나는 혈관 투과성의 증가에는 leukotrienes, histamine, bradykinin, serotonin, platelet-activating factor 등 다른 매개체보다 NO와 peroxynitrite가 중요한 역할을 하는 것이 아닌가 생각한다.
   비세정액 내의 알부민 농도는 대조군에 비해 오존노출군에서 증가된 경향을 보였으며, 오존노출+ebselen 투여군에서는 오존노출군에 비해 약간 감소한 경향을 보였다. Ishii 등¹⁶⁾은 Sprague-Dawley rat에서 2 ppm의 오존에 4시간 노출 후 기관지폐포세정액 내의 알부민 농도를 측정하였을 때 ebselen 투여군에서 투여하지 않은 군에 비해 유의하게 감소하였다고 하였으며, 본 연구의 결과도 이들의 결과와 유사하였으나 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 이는 실험동물의 종류, 세정액의 종류, 오존노출 기간과 농도, 투여한 ebselen의 양, 알부민 측정방법 등에 차이가 있기 때문이라 생각한다.
   비세정액내의 호중구 수는 기관지폐포세정액을 대상으로 한 Ishii 등¹⁶⁾의 연구에서와 같이 대조군에 비해 오존노출군에서 유의하게 증가되어 있었으며, 오존노출+ebselen 투여군에서는 오존노출군에 비해 유의하게 감소함을 보였다.
   이상의 결과로 ebselen은 오존노출에 의해 유발된 비점막의 염증에서도 혈관투과성 증가를 억제하고 혈장 유출을 줄이며 염증세포, 특히 호중구의 침윤을 줄이는 항염증작용이 있음을 알 수 있었다.
   알레르기 비염, 기관지 천식 등의 기도 염증성 질환의 병태생리에 NO가 중요한 역할을 하는 것으로 생각되고 있으며,¹¹⁾²⁰⁾ NO와 과산소의 반응에 의해 생성되는 peroxynitrite는 기도점막에서 혈관내피세포의 손상에 의한 혈관투과성 증가, 혈장 유출을 일으키며, 점막표면에 존재하는 표면활성물질(surfactant)의 기능과 합성을 억제하고, 상피세포의 손상과 투과성 증가를 초래하여 기도점막의 염증과 과민성을 초래하는데 큰 역할을 하는 것으로 알려져 있다.⁹⁾
   본 연구에서도 비점막에서 NO의 합성에 관여하는 iNOS와 peroxynitrite의 존재 및 활성도를 간접적으로 알 수 있는 nitrotyrosine에 대한 면역염색을 시행한 결과 대조군에서는 거의 발현되지 않았으나 오존노출군에서 강하게 발현되어 오존노출 후 발생하는 비점막의 염증과 상피세포의 손상 등의 생화학적, 형태학적 변화에 NO와 peroxynitrite가 관여함을 알 수 있었다. iNOS는 주로 점막하 고유층에 침윤된 염증세포에서 발현되었고 nitrotyrosine은 상피세포, 점막하분비선 등에서 강하게 발현되어 오존노출 후 침윤된 호중구나 대식세포 등의 염증세포가 NO의 주 생산세포이며 이에 의해 생산된 peroxynitrite는 상피세포, 점막하분비선 등에 손상을 주는 것으로 생각된다.
   반면 ebselen 투여군에서는 오존노출군에 비해 iNOS와 nitrotyrosine의 발현이 현저하게 감소되어 있었다. 따라서 ebselen은 오존노출 후 iNOS가 발현되는 것을 억제하고 그로 인해 NO의 생산을 억제하며, 이미 생산된 peroxynitrite에 대한 scavenger로 작용하여 NO와 peroxynitrite에 의한 세포손상을 줄일 수 있을 것으로 생각한다. 
   결론적으로 오존노출 후 비점막에서 발생하는 혈관투과성의 증가, 혈장 유출, 염증세포의 침윤, 상피세포의 손상 등의 염증반응에 NO와 그 화합물질인 peroxynitrite가 중요한 역할을 하며 과산소, NO, peroxynitrite 등의 생산을 억제하는 것으로 알려진 ebselen이 오존노출에 의한 비점막의 염증반응을 완화할 수 있을 것으로 생각한다.

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