교신저자：노환중, 602-739 부산광역시 서구 아미동 1가 10번지  부산대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   비강에 존재하는 펩타이드계 신경전달물질인 substance P, calcitonin gene related peptide, neurokinin A, neuropeptide Y 및 vasoactive intestinal polypeptide 등은 지각신경, 교감 및 부교감 신경분지에 있는 기존의 알려진 신경전달물질과 상호작용을 하여 알레르기비염의 비특이적 과민성에 관여한다고 알려져 있다.¹⁾ 정상적인 비강 조직에서 이러한 펩타이드계 신경전달물질의 생리작용과 알레르기비염의 병인 기전에 관한 연구는 있지만, 중추신경계에 신경전달물질로서 존재하는 아미노산계 신경전달물질과 기타 아미노산이 비강 조직에도 존재하는지 그리고 알레르기비염의 병인으로서 그 역할과 기능에 관한 연구는 현재까지 보고 된 바 없다. 최근 천식환자의 기관지 폐포 세척액에서의 아미노산 측정,²⁾ 천식환자의 폐에서 gamma-amino-butyric acid(GABA) 수용체의 발현과 GABA에 의한 기관지 평활근의 콜린성 수축의 억제,³⁾ 하부기도에서 콜린성 부교감 신경계의 glutamate 수용체 존재⁴⁾가 보고되었지만 모두 하부기도인 기관지와 폐에서 아미노산에 관한 연구이고, 비강에서의 연구는 아직 없는 실정이다.
   한편 약물이나 신경전달물질에 의한 표적장기의 반응을 판정하는데 있어 전통적으로는 혈액의 대사물질의 양과 농도를 측정해 왔는데 이는 직접적인 세포내 대사과정을 반영하는 세포외액의 양과 농도와는 차이를 보여 정확히 표적장기의 반응을 나타낼 수 없었다. 최근에는 삼투압 평형 원리를 적용한 미세투석법을 이용하여 세포내의 대사물질 또는 생성물질들을 직접 채취하고 그 양과 농도를 측정할 수 있는 방법이 개발되어 성공적인 결과를 보고하고 있다. 미세투석법은 대부분 중추신경계의 신경전달물질 측정에 사용되었으나 말초장기인 지방 조직, 눈, 부신, 심장, 간, 신장, 췌장, 유방, 근육, 난소, 자궁 등의 연구에도 이용하고 있다.⁵⁾ 알레르기에 대한 미세투석법을 이용한 연구는 인간 피부에서 히스타민과 펩타이드계 신경전달물질을 측정한 연구⁶⁾가 있으나, 알레르기비염의 비강 조직에서 미세투석법을 이용한 국소 반응물질의 측정은 시도된 바 없으며, 특히 비강 조직 내 아미노산의 연구에 사용되어 보고된 적이 없다.
   따라서 저자는 정상 기니픽 비강과 실험적으로 유발된 알레르기비염 모델의 비강 조직에서 미세투석법을 이용하여 19개 아미노산 농도를 측정하고 그 변화를 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

동  물
   생후 4주된 200~250 g의 건강한 Dunkin-Hartely계 수컷 기니픽 16마리를 사용하였다. 아무런 약물처리를 하지 않은 대조군(N=8)과 알레르기비염 유발 실험군(N=8)의 2군으로 나누었다.

알레르기비염 유발 동물모델의 제작
   Kawaguchi 등⁷⁾의 방법을 변형하여 8마리의 기니픽을 대상으로 난알부민(ovalbumin；bovine serum albumin, Sigma, USA)의 복강내 주사와 비강내 국소 감작의 스케쥴로 알레르기비염을 실험적으로 유발하였다(Fig. 1).

복강내 감작
   난알부민 4 mg에 생리식염수를 가하여 4 mg% 용액을 만들어, 이 용액 0.5 ml와 복강내 감작을 할 때 사용하는 면역보강제 20 mg/ml 농도의 수산화 알루미늄 겔{Al(OH)3gel} 0.5 ml를 섞어 이 혼합물 1 ml를 기니픽 우측 아래쪽 복강내에 주사하였다. 복강내 주사는 2주일 간격으로 모두 5회 실시하였다.

비강내 감작
200×220×200 mm 크기의 아크릴 상자를 만들고 그 측면 상단에 적당한 크기의 구멍을 내어 미세분무기(ultrasonic nebulizer：NE-U07, OMRON, USA)와 연결하였다. 아크릴 상자의 밑면에는 기니픽의 발이 빠지지 않을 정도의 작은 구멍을 여러개 뚫어 공기의 출입이 가능하게 하였다. 마지막 복강내 주사 1주일 후 기니픽을 이 상자에 넣고 0.1% 난알부민 용액으로 5분간 분무하였다. 이 분무과정을 매주 5회씩 4주간 시행하였다.

미세투석법을 이용한 비강점막내 시료채취

미세투석관의 검정
   미세투석법에 사용된 동심형의 미세투석관은 Cuprophan hollow fiber(200 μm 내경, 300 μm 외경, 45 kDa molecular weight cut-off, Fitral, AN 69-HF, Hospal, Lyon, France)를 사용하여 만들었다(Fig. 2). 미세투석관은 10% glucose 용액으로 관류하여 미세투석관의 회수율이 20% 이상인 것만을 사용하였다. 본 연구에서는 투석막의 길이를 2 mm로 하여, 2 μl/min의 관류 속도에서 회수율이 평균 24%를 나타내었다. 미세투석관은 제작된 후 자외선과 70% 알코올로 소독하고 사용 전에 멸균생리식염수로 세척하였으며, 그 세척액의 균배양검사에서 멸균인 상태를 확인하였다. 또한 실험 도중 비강 조직으로 삽입되는 부위, microinfusion pump(Baby Bee syringe pump, BAS, Lafayette, IN)의 부착부위, 시료를 모으는 부위는 멸균 상태가 유지되도록 하였다(Fig. 3).

미세투석법
   대조군과 알레르기비염 실험군의 최종 비강 점적 24시간 후 비강 조직에 대한 미세투석을 실시하였다. 미세투석법은 Lawrence 등⁸⁾의 방법을 수정하여 사용하였다.
   먼저 각 실험동물에 대해 5% urethane을 1500 mg/kg의 농도로 복강내 주사하여 전신마취를 유도한 후, 비강내 미세투석 작업을 위한 기도확보를 위해 기관절개술을 시행하고 cut-down tube를 삽관하고 white silk 4-0로 기도와 tube를 고정하여 기도를 유지하였다. 기니픽 콧등을 절개하여 하비갑개를 노출한 후, 하비갑개의 가장 돌출된 점막 부위에 미세투석관 삽입을 위하여 현미경하에서 11번 메스를 이용해 직경 2 mm, 깊이 5 mm 정도로 점막 표면에 절개를 가하였다. 미세투석관의 검정 후 1 cc Hamilton 주사기에 미세투석관을 연결하고, 주사기를 미세투석을 위한 microinfusion pump에 장치시킨 후 미세투석관 끝까지 생리식염수를 채웠다. 투석막이 있는 미세투석관의 말단 부분을 하비갑개 점막 절개부위에 현미경하에 삽입하여 미세투석막이 점막하에 위치한 다음 microinfusion pump를 작동시켜 2 μl/min의 속도로 관류하였다. 조직과 관류액이 삼투평형을 이루도록 첫 60분의 관류액은 버리고 이후 30분 간격으로 연속 4회의 시료를 채취하였다. 채취 당시 기온에 의한 아미노산의 농도 변화를 막기 위해 얼음을 채운 용기 안에 채취용기인 Eppendorf tube를 담아 관류액을 채취하였으며, 채취한 각 시료는 즉시 -70℃ deep freezer에 보관하였다(Figs. 3 and 4).

아미노산계 신경전달물질의 측정
   19개 아미노산(alanine, arginine, aspartate, cysteine, GABA, glutamate, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, taurine, threonine, tyrosine, valine)의 농도를 high performance liquid chromatography(HPLC, Waters, USA)의 AccQ-Tag 방법으로 측정하였다. 아미노산 농도가 2.5 μmol/ml(cystine-1.25 μmol/ml)인 표준품을 단계적으로 희석하여 표준용액을 만들고 유도체화시킨 후 채취된 각 그룹의 시료에 대해 HPLC에 주입하여 얻어진 chromatogram으로 표준품의 유지시간과 지체시간을 확인하였다. 각 chromatogram의 면적비로 검량선을 작성하였고, 작성된 검량선에 의하여 시료에서 아미노산 농도를 계산하였다. 시료의 주입은 autosampler를 이용하였으며, 분석조건은 excitation wavelength(250 nm) 및 emission wavelength(395 nm), 분석온도는 37℃로 유지하였다.

통계학적 검정
   모든 수치는 평균±표준오차로 기록하였으며 대조군과 알레르기비염 실험군 사이의 아미노산 농도에 대한 분석은 student t-test로 하였고, p값이 0.05 미만인 경우를 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

결     과

대조군과 실험군 간의 아미노산 평균 농도
   대조군에 비하여 알레르기비염 실험군에서 alanine, aspartate, GABA, glutamate, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, taurine, tyrosine의 평균 농도가 높았으며, 이중 의미 있는 농도 차이를 보인 아미노산은 glutamate(p=0.036)와 GABA(p<0.001)이었다. 반면에 arginine, cysteine, glycine, histidine, isoleucine, serine, threonine, valine의 평균 농도는 실험군이 대조군에 비하여 낮았으나, 통계학적인 유의성은 없었다(Table 1).

고     찰

   펩타이드계 신경전달물질로서 substance P, neurokinin A, neuropeptide Y, neuropeptide K, calcitonin gene related peptide 등은 비강내의 감각신경의 말단에 존재하여 축색반응 경유의 혈관확장, 혈장누출, 선분비 등의 신경성 염증반응과 알레르기 비염의 비특이적 과민성에 관계한다.¹⁾ 이와 같이 펩타이드계 신경전달물질의 정상 비강에서 생리작용과 알레르기비염의 병인적 역할에 대한 연구는 많으나, 중추신경계에 존재하는 아미노산계 신경전달물질이나 기타 아미노산이 비강 조직에 존재하는지와 알레르기비염의 병인 기전에서 어떻게 작용하는지에 대한 연구는 아직 없다.
   현재까지 아미노산이 하부호흡기인 폐-기관지의 질환에 생리적 그리고 생화학적 반응에 관여한다고 알려져 있다. Arginine은 nitric oxide의 전구 물질로서 혈압과 기관지 평활근의 기저 톤 조절자로서의 역할을 하며 천식 환자의 스테로이드 흡입 치료시 약리작용에 관여한다.⁹⁾ 또한 glutamate와 aspartate는 기관지 평활근의 수축반응을 조절하며,¹⁰⁾ taurine은 중추신경계의 억제성 신경전달물질, 삼투압 조절자, 항산화제, 심장근 수축성 물질, 그리고 혈소판 응집에 관여하는 것으로 알려져 있다.¹¹⁾ 중추신경계에서 신경전달물질로 알려진 아미노산은 serotonin, tryptophan, GABA, glutamate, aspartate, glycine, histamine, histidine, tyrosine, adenosine, arginine 등인데, 그 중 glutamate, aspartate, tyrosine, tryptophan은 흥분성 신경전달물질, glycine, taurine, GABA는 억제성 신경전달물질이다.¹²⁾ 본 연구에서 19개 아미노산이 정상 기니픽의 비강 조직에 다양한 농도로 존재함이 밝혀졌다. 그 중 흥분성 신경전달물질인 glutamate와 억제성 신경전달물질인 GABA가 알레르기비염을 유발시킨 알레르기 비강 조직에서 의미있게 높게 나타났다. 이 두 아미노산이 중추신경계에서와 같이 말초 장기인 비강에서도 신경전달물질로서 작용을 하는 지에 대해서는 본 연구 결과로서 명확한 결론을 내리지 못하지만 그 가능성은 있을 것으로 사료되며 추후 지속적인 연구가 필요하다.
   중추신경계에서 억제성 신경전달물질로 작용하는 GABA의 기관지에서 역할에 관한 연구는 비교적 활발히 이루어져 있다. 폐에서 GABA 수용체를 발견¹³⁾ 후 Tohda 등¹⁴⁾과 Dicpinigaitis 등¹⁵⁾은 천식환자에서 기도 폐색의 기전을 접합전 GABA B 수용체의 기능부전 때문이라고 설명하였고 천식환자에서 GABA B 항진제인 baclofen을 사용하여 기관지 수축제에 대한 기도의 과민 반응을 효과적으로 억제했다고 보고하였다. 이와 같이 GABA와 그 수용체가 콜린성 기관지 평활근의 수축에 관여하는 신경전달물질로서의 역할에 관한 보고는 있으나, 비강에서의 GABA와 그 수용체의 존재 유무에 대한 연구는 없었다. 본 연구에서 대조군과 알레르기비염 실험군의 GABA의 평균 농도는 각각 0.029±0.065 pmol과 0.29±0.28 pmol로 실험군의 농도가 대조군에 비해 의미 있게 높게 나타났다. 이러한 현상은 정상적으로는 매우 낮은 농도로 존재하는 GABA가 항원의 감작에 의해 항상성이 깨어지면서 알레르기 반응을 억제하기 위해 보상적으로 증가한 것으로 추정할 수 있거나, 대조군의 농도가 매우 낮아서 미세투석관의 삽입에 따른 아주 미세한 농도 변화에도 의미 있는 농도 변화를 보였다고 생각할 수 있다. 본 연구의 결과만으로 비강내에서 GABA의 역할이 기관지에서와 같이 콜린성 부교감신경계에 억제성으로 작용하는지는 확실한 결론을 낼 수 없다. 이는 알레르기비염 치료에 사용되는 스테로이드나 항콜린제를 사용한 후에 어떤 변화를 보이는지 연구해 보면 보다 명확해질 수 있을 것이며, GABA 수용체의 존재 유무를 포함하여 앞으로 더욱 많은 연구가 필요한 부분이다.
   비강에서 glutamate가 알레르기비염에서 역할을 할 것이라는 가설은 세 가지 측면에서 생각할 수 있다. 첫째 조미료의 성분이 되는 monosodium glutamate(glu-Na+, MSG)가 중국식당증후군의 원인이라는 사실이다.¹⁶⁾ 이것은 MSG에 의하여 안면홍조, 발한, 심박동수 감소, 두드러기, 호흡곤란 등 부교감신경의 자극에 의한 증후군으로서, 실험적으로도 MSG에 의한 기관지 천식 유발이 가능하다. 둘째 호흡기의 콜린성 부교감신경계에서 glutamate 수용체가 존재하고 이는 기관지 평활근 신경말단에서 기관지 평활근의 수축에 관여하며,⁴⁾ MSG에 의한 천식에도 부교감신경계 신경전달물질로서의 glutamate에 의한 것이라는 보고가 있다.¹⁷⁾ 셋째 비강 점막에 glutamate 수용체가 존재하고 신경전달물질로서 glutamate 작용을 예측하게 하는 것은 유럽에서 이미 통년성 및 계절성 알레르기비염 치료 약제로서 사용중인 Rhinaaxia(Zy 15106)이다.¹⁸⁾ Rhinaaxia는 N-acetyl-aspartyl-glutamic acid(NAAGA)의 magnesium salt 형태로서, NAAGA는 뇌의 glutamate 수용체에 강한 친화력을 가진 내인성 dipeptide 신경전달물질이다. Glutamate 수용체에 대하여 glutamate와 강력한 경쟁적 길항제인 NAAGA가 알레르기비염의 치료 약제로 사용하게 된 기전은 비만세포의 탈과립을 방지, anaphylatoxin인 C3a, C5a 등의 보체활성의 억제, 히스타민 뿐만 아니라 류코트리엔 B4, C4, D4 분비의 억제, 혈관내피세포의 접착분자 발현 조절을 통한 염증세포의 recruitment 억제¹⁹⁾ 등으로 보고 하고 있다. 그러나 glutamate가 부교감신경계의 새로운 신경전달물질로서 알레르기비염의 신경성 염증에 깊이 관여하는지, NAAGA가 과연 glutamate 수용체에 경쟁적 길항제로서 작용하여 알레르기비염의 치료에 효과가 있는지에 대한 분석은 이루어지지 않았다. 본 연구에서 알레르기비염 실험군이 대조군에 비하여 의미있게 glutamate의 농도가 높은 결과와 상기한 세가지 측면에서 생각할 때 glutamate는 비강에서 부교감신경계의 새로운 아미노산계 신경전달물질일 높은 가능성을 제시한다.
   본 연구에서 이용한 미세투석법은 미세투석관에 생리적인 투석액을 흐르게 하면서 표적 조직에 삽입하여 유치하면 시간이 경과함에 따라 미세투석관에 존재하는 미세투석막을 통하여 표적 조직 내 세포외액과 평형이 이루어진 후 관류액을 추출하여 화학적 성분을 분석하는 것이다. 이것은 Gaddum 등에 의해 push-pull cannulae 형태로 처음 소개된 이래, Bito 등의 dialysis sac, Delgado 등의 dialytrode 등으로 개발이 되었고, Ungerstedt에 의해 현재 많이 사용되는 microdialysis probe의 모델로 발전되었다.⁵⁾ 또한 미세투석법은 약물을 투여한 후 표적조직에서 약물의 최종 대사물질 농도와 혈중의 대사물질 농도를 측정하여 약물의 표적조직에의 전달정도를 알 수 있는 약물역동학 연구에도 장점이 있다. 본 연구에서 미세투석 첫 60분 동안 관류시켜 회수한 투석액은 버리고, 그 후 30분 간격으로 4회에 걸쳐 투석액을 회수하여 분석하였는데, 투석관을 거치한 초기에는 조직의 손상으로 당대사가 감소하고 신경전달물질의 유리가 흐트러질 수 있으며, 이와 같은 반응은 투석관 삽입 후 몇 분에서 수십 분 동안 지속되나 처음 급격하게 증가되었던 전달물질의 수치가 30~40분 전후에서 빠르게 감소하여, 정상적인 기본치에 도달하게 되기 때문이다.
   본 실험은 미세투석법을 이용하여 기니픽 비강 조직에서 아미노산의 존재와 그 농도를 측정할 수 있었고 유발된 알레르기비염에서 glutamate와 GABA가 의미 있게 높은 농도로 존재함은 두 아미노산이 알레르기비염의 병인에 관여하여, glutamate는 부교감신경계의 신경전달물질로, GABA는 콜린성 부교감신경계에 억제성 물질일 가능성을 제시하였다.
   이와 같은 결과는 향후 비강 조직에서 아미노산의 생리적 기능과 알레르기비염 병리기전에서 갖는 역할 규명에 중요한 자료를 제공할 것으로 사료된다. 또한 본 연구에서 응용되었던 비강 조직의 미세투석법은 세포외 환경을 잘 반영하고 동시에 대사물의 혈중 농도와 함께 비강 조직에서의 농도를 측정할 수 있으므로 비강의 약물역동학 연구에 큰 이점을 줄 수 있다. 따라서 개발된 미세투석법을 이용하여 알레르기비염 뿐 아니라 부비동염과 같은 염증성 질환에 대하여 항생제나 스테로이드 등 치료약물의 비강 조직내 전달율, 약물에 의한 각종 사이토카인의 변화 등을 분석할 수 있으므로 비과 영역의 치료 연구에도 상당한 기여를 할 수 있을 것으로 사료된다.

결     론

   미세투석법을 이용하여 중추신경계의 신경전달물질로서 존재하는 아미노산과 그 외의 아미노산이 비강 조직에 존재함을 밝혔고, 유발된 알레르기비염에서 glutamate와 GABA가 의미 있게 높은 농도로 존재하였다. Glutamate는 부교감신경계의 신경전달물질, GABA는 콜린성 부교감신경계에 억제성 물질로 작용할 것으로 추정하며, 향후 이에 대한 지속적인 연구는 비강의 말초신경계와 알레르기비염의 병인 규명에 중요한 자료를 제공할 것으로 사료된다. 또한 본 연구에 사용되었던 비강 조직용 미세투석법은 표적조직의 세포외 환경을 잘 반영하므로 아미노산 측정뿐만 아니라 비강에서 약물역동학 연구에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

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