교신저자：나기상, 301-721 대전광역시 중구 대사동 640  충남대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(042) 280-7698 · 전송：(042) 253-4059 · E-mail：ksrha@cnu.ac.kr

서     론

   최근 산업화, 도시화의 영향으로 인한 대기오염의 악화가 천식을 비롯한 알레르기 질환의 유병률을 꾸준히 증가시키는 것으로 추정되고 있다.^1,2) 오존은 광화학적 스모그의 주된 성분을 이루는 자극적인 산화 기체로, 기관지 천식이나 알레르기비염 등의 질환을 갖는 환자의 경우 대기 중의 오존노출에 의해 증상이 악화될 수 있음을 여러 문헌에서 보고하고 있다.^3,4) 특히 천식의 발작과 오존의 노출과의 상관관계가 자주 보고되고 있지만 이들의 기본적인 기전에 대한 연구는 드물다.
   천식 동물모델에서의 난알부민을 지속적으로 노출하였을 때 기도 재형성이 일어난다는 것은 이미 잘 알려진 사실이다. 그에 비해 비강 점막에서는 실험동물을 알레르기 항원에 지속적으로 노출하였을 때 배상세포의 증가, 점막하 섬유화 증가, 편평상피로의 화생, MMP-9과 TIMP-1의 발현증가, 점막하 분비선의 비대 등이 정상군에 비해 증가하지만 천식에서 보이는 것처럼 광범위하게 일어나지는 않는 것으로 알려져 있다.^5,6)
   그동안 동물모델을 이용하여 알레르기 항원에 의한 기도 염증반응에서 오존노출이 어떠한 영향을 미치는지 여부에 대한 여러 연구들이 있었다.^7,8) 하지만, 기존의 연구들은 폐를 포함하여 하기도에 국한되어 있고 알레르기 비염에서 비강점막의 재형성과 이 과정에서 오존의 영향에 대한 연구는 거의 없는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 마우스를 이용하여 난알부민 알레르기 모델을 만들고 지속적인 난알부민 노출로 기도의 재형성을 유도하였다. 그리고 난알부민 노출 중 오존에 반복적으로 노출함으로써 비강을 포함한 기도의 재형성에서 오존의 역할을 알아보고자 하였다. 

재료 및 방법

실험동물
   특정 무병원체(specific pathogen free) 환경에서 사육된 5주령 BALB/c 마우스 40마리를 사용하였다. 실험 1주일 전부터 온도 20~23℃, 습도 45~70%의 실험실에서 사육하여 실험실 환경에 적응하도록 하였으며, 이 기간 내에 상기도 감염의 증상이나 다른 질환이 관찰되는 생쥐는 실험에서 제외하였다.

실험군의 분류
   동물은 네 군으로 나누어 각 군에 10마리씩 배정하였다(Fig. 1).

Group I 대조군
   0일, 7일, 14일째 phosphate buffered saline(PBS)을 복강 내에 투여하였으며, 난알부민 에어로졸 대신 PBS 에어로졸에 노출되도록 하였고, III군과 IV군이 오존에 노출되는 동안에는 의료용 공기를 흡입하도록 하였다.

Group II 난알부민 분무군
   0일, 7일, 14일째 전신감작을 위해 난알부민-aluminum hydroxide gel 혼합액을 복강 내에 주사하였고, 난알부민 국소 감작을 유발하기 위해 21일째부터 27일째까지 매일 30분간 분무하여 알레르기 반응을 유도하였다. 28일째부터 같은 방법으로 주 3회 1시간씩 분무를 통한 국소 감작을 시행하였다.

Group III 오존노출군
   0일, 7일, 14일째 PBS를 복강 내에 투여하였으며, 21일째부터 27일째까지 매일 30분간 난알부민 에어로졸 대신 PBS 에어로졸에 노출하였다. 이후에는 0.5 ppm의 오존에 하루 4시간씩 일주일에 3차례, 10주간 노출하였다.

Group IV 난알부민 분무와 함께 오존노출을 시행한 군
   난알부민 분무군과 동일하게 전신감작과 국소감작을 시행하여 알레르기 반응을 유발하였고, 28일째부터 같은 방법으로 주 3회 1시간씩 분무를 통한 국소감작을 시행하였으며 같은 기간 중 0.5 ppm의 오존에 하루 4시간씩 일주일에 3차례, 10주간 노출하였다.

기도 재형성 모델의 제작
   난알부민(Ovalumin, chicken egg albumin, Sigma Chemical Co. Phillipsberg, NY, USA) 0.25 mg과 aluminum hydroxide {Al(OH)₃} gel 10 mg을 PBS용액 3 ml에 30분 이상 혼합하여 3.3 mg/ml Al(OH)₃에 흡착된 0.25 mg의 난알부민 혼합액을 만들어 0.3 ml을 0일, 7일, 14일째에 생쥐의 복강 내에 주사하여 전신 감작을 시켰다. 국소감작을 위해 40×40×30 cm 크기의 아크릴 상자를 만들고 그 옆면에 구멍을 내어 분무기와 연결하였다. 분무용 난알부민 용액은 PBS 1 ml에 난알부민 10 mg을 녹여 만들었으며, 21일째부터 27일째까지 7일간 아크릴 상자 내에서 분무기(Pulmo-Aide^®, Devilbiss, Somerset, PA, USA)를 이용하여 1% 난알부민 용액을 매일 30분간 분무하여 알레르기 반응을 유도하였다. 이후 같은 방법으로 주 3회 1시간씩 10주 동안 비강 내 국소감작을 시행하여 기도재형성을 유도하였다.

오존 노출
   오존 폭로상자는 전신흡입상자(whole-body inhalation chamber)의 형태로 30×20×17 cm의 크기로 제작하였다. 오존발생기(SMO-200 ozone generator, Samsung Magic Ozone, Korea)를 사용하여 발생된 오존은 10 L/min의 의료용 공기와 섞여 상자 내로 유입되도록 하였다. 오존측정기(Portasens model B16-14, Analytical Technology, Oaks, PA, USA)를 사용하여 상자 내의 오존농도를 측정하면서 오존의 유입량을 조절하여 농도를 0.5 ppm으로 맞춘 다음 폭로시간 내내 일정한 농도가 유지되는지 감시하였다. 그리고 배출구로 나오는 오존은 활성탄을 통하도록 하여 정화한 다음 배출되도록 하였다. 

알레르기 증상 변화의 관찰
   국소 감작 후 10주째 마우스를 희생시키기 전 15분간 각각의 마우스에서 재채기 횟수와 코를 비비는 동작의 횟수를 측정하여 이들의 합을 증상점수로 기록하여 비교하였다.

비세정액과 기관지폐포세정액 채취
   마지막 국소감작을 하고 24시간 후에 비세정액과 기관지폐포세정액을 채취하였다. 기관절개를 가하고 기관절개 창을 통해 cut-down tube를 삽입하여 관의 끝을 기관 분기부에 위치한 후 0.1 M PBS 용액을 1 ml를 5분 이상에 걸쳐 서서히 주입하였다가 빼내어 기관지폐포세정액을 얻었다. 이후 비세정액을 받기 위해 머리를 신전하여 전비공이 가장 낮게 위치하도록 한 다음 기관절개창을 통해 다시 cut-down tube를 삽입하여 관의 끝을 후비공에 위치하도록 한 다음 0.1 M PBS 용액 1 ml를 5분 이상에 걸쳐 점적하고 전비공으로 흘러나오는 비세정액을 받았다. 세정액 내의 cytokine을 측정하기 위하여 원심분리(100 g, 5분)한 다음 상청액 0.5 ml을 채취하여 측정 전까지 -70℃에서 보관하였고 나머지는 세포수의 측정을 위해 따로 보관하였다.

비점막과 폐 조직의 채취
   Trichrome 염색과 면역조직화학염색을 시행하기 위하여 비강과 폐 조직을 채취하였다. 마우스의 머리를 몸통에서 절단한 후 비강을 둘러싸고 있는 골을 포함하여 채취한 후 하악, 피부와 근육 등을 제거한 다음 24시간 동안 10% paraformaldehyde 용액에 넣어 고정한 후 탈회를 위해 0.25 M ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA)용액에 담가두었다. 상절치 바로 뒤에서부터 경구개의 절치유두(insicive papilla)의 약 2 mm 전방부위까지 절단하여 블록을 만들고 파라핀 포매 후 5 μm의 두께로 절편을 만들었다.
폐 조직은 흉부를 절개하여 채취한 후 10% formaldehyde solution 용액을 이용하여 고정하고 paraffin block을 제작하였다.

비세정액과 기관지폐포세정액 내에서 기도재형성과 관련된 Cytokine 측정
   비세정액과 기관지폐포세정액 내의 IL-5, IL-13, INF-γ, TGF-β의 양을 ELISA를 이용하여 측정하였다. 간략하게 기술하면, 96-well plate(NUNC Immunoplate Maxisorp F96, Basel, Switzerland)에 rat anti-mouse IL-5, INF-γ, TGF-β(BD Biosciences, San Diego, CA, USA), IL-13(R&D systems, Minneapolis, MN, USA) capture antibody를 carbonate coating buffer(pH 9.5)로 희석하여 입힌 후 4℃에서 하룻밤 동안 정치하였다. Washing buffer (0.1% Tween 20/PBS, pH 7.2)로 3회 반복하여 세척한 다음 비특이적 반응을 억제하기 위하여 Assay Diluent (10% FBS/PBS, pH 7.0, BD Biosciences)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 다시 완충액으로 3회 세척한 다음 cytokine standard 용액(BD Biosciences) 혹은 비세정액 0.1 ml를 첨가한 후 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 다시 세척한 다음 Working Detector(Detection Antibody+Avidin-HRP reagent, BD Biosciences)를 첨가하고 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 다시 7회 세척한 후 기질용액(substrate solution)을 넣은 다음 어두운 곳에서 30분 동안 보관하였고, 그 후 중지용액(H₂SO₄)을 이용하여 반응을 정지시키고 microplate spectrophotometer(SPECTRA MAX Plus, Molecular Devicies, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 각각의 흡광도를 측정하였다.

비세정액 및 기관지폐포세정액 내의 호산구와 림프구 수 측정
   비세정액 및 기관지폐포세정액을 원심 분리하여 남은 액을 이용하여 호산구의 수와 림프구의 수를 측정하였다. Cytospin(Shandon Cytospin 4, Thermo, UK)을 이용하여 슬라이드 위의 5 mm의 직경을 갖는 원 안에 세포들이 고르게 분포하도록 한 다음 Wright Giemsa염색을 하였다. 400배의 현미경하에서 무작위로 5시야를 선정하여 호산구와 림프구의 수를 세고 평균을 낸 다음, 전체 원의 면적과 한 시야의 면적의 비를 구하여 곱함으로써 비세정액 내의 총 호산구 및 림프구 수를 구하였다.

Trichrome 염색
   상피하 섬유화의 정도를 알아보기 위해 trichrome을 이용하여 염색을 하였고 그 염색정도는 광학현미경(BX51 TRF, Olympus, Japan)에 부착된 image analysis system(Meta Imaging Series 6.1, Molecular devices, PA, USA)을 이용하여 정량적인 분석을 하였다. 

면역조직화학염색
   비강과 폐 조직 절편을 탈파라핀화한 다음 비특이적 반응을 억제하기 위하여 3% H₂O₂와 10% FBS를 첨가한 후 일차항체로 goat anti-mouse MMP-9 또는 goat anti-mouse TIMP-1 항체(Santa Cruz, San Diego, CA, USA)를 1：200으로 희석하여 4℃에서 반응시켰다. 이후 biotinylated anti-goat antibody와 streptavidin HRP(DAKO, LSAB kit, Denmark)를 각각 약 1시간과 30분 동안 반응시켰다. 이어 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride 용액에 의한 발색반응을 거쳐, hematoxylin으로 대조염색을 하였다. 음성 대조군으로는 일차항체 대신 인산완충용액을 사용하여 같은 방법으로 시행한 후 관찰하였다.
   면역염색의 정량적인 분석을 위해 슬라이드를 400배 광학현미경으로 각각 10군데의 시야에서 관찰하였고, image analysis system(Meta Imaging Series 6.1, Molecular devices)을 이용하여 전체 면적에 대한 MMP-9 혹은 TIMP-1으로 면역염색된 면적의 비율을 측정하였다.

자료 분석 및 통계처리 방법
   각 군 사이에 유의한 차이가 있는지를 알아보기 위하여 SPSS version 12.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)의 분산 분석(one way-ANOVA)를 이용하였고, 유의수준은 p<0.05로 정하였다.

결     과

항원 투여 후 유발된 알레르기 증상(Fig. 2)
   난알부민을 이용한 국소감작 후 15분 동안 코를 비비는 횟수와 재채기 횟수를 합한 증상점수는 대조군(I) 56±4.7, 난알부민 분무군(II) 226.7±27.3, 오존노출군(III) 205.5±13.7, 난알부민과 함께 오존을 노출한 군(IV)은 215.5±16.1이었다. I군에 비해 II, III, IV군의 증상점수가 통계적으로 유의하게 증가하였고(p<0.000), II, III군과 IV군 사이에는 통계적인 유의성이 없었다.

비세정액과 기관지폐포세정액 내 Cytokine 농도

IFN-γ(Fig. 3A)
   비세정액 내에서 측정한 IFN-γ의 농도는 I군이 51.41±2.74, II군이 56.66±10.51, III군이 56.42±10.55, IV군이 57.6±9.83 pg/ml였고, 각 군 사이에는 통계적인 유의성이 없었다.
   기관지폐포세정액 내에서 측정한 IFN-γ의 농도는 I군이 63.35±6.03, II군이 79.67±7.74, III군이 78.91±9.06, IV군이 81.7±10.83 pg/ml였고, I군에 비해 II, III, IV군에서 통계적으로 유의한 증가를 보였다.

IL-5(Fig. 3B)
   비세정액 내의 IL-5 농도는 I군이 43.9±4.1, II군이 56.87±7.82, III군이 57.7±7.99, IV군이 70.46±8.02 pg/ml였고, I군에 비해 II, III, IV군에서 통계적으로 유의하게 증가하였으며(p<0.05), IV군은 II군과 III군에 비해 유의하게 증가하였다(p<0.05). 
   기관지폐포세정액 내의 IL-5 농도는 I군이 107.26±8.70, II군이 198.75±44.72, III군이 200.32±11.85, IV군이 235.98±13.66 pg/ml였고, 비세정액과 비슷하게 I군에 비해 II, III, IV군에서 통계적으로 유의하게 증가하였으며(p<0.05), IV군은 II군과 III군에 비해 유의하게 증가하였다(p<0.05).

IL-13(Fig. 3C)
   비세정액 내의 IL-13 농도는 I군이 20.9±1.92, II군이 33.24±3.63, III군이 32.74±3.85, IV군이 41.48±5.41 ng/ml로 I군에 비해 II, III, IV군에서 통계적으로 유의하게 증가하였다(p<0.05). 그리고 IV군은 III군에 비해 유의하게 증가하였다(p<0.05). 
   기관지폐포세정액 내의 IL-13 농도는 I군이 23.44±2.27, II군이 36.03±4.46, III군이 36.28±5.44, IV군이 45.15±1.87 ng/ml였고, I군 비해 II, III, IV군에서 통계적으로 유의하게 증가하였으며(p<0.05), IV군은 II군과 III군에 비해 유의하게 증가하였다(p<0.05).

TGF-β(Fig. 3D)
   비세정액 내의 TGF-β 농도는 I군이 877.52±18.90, II군 993.5±79.75, III군 1027.37±73.85, IV군 1030.33±104.71 pg/ml였고, I군에 비해 II, III, IV군에서 통계적으로 유의하게 증가하였다(p<0.05).
   기관지폐포세정액 내의 TGF-β 농도는 I군 1814.61±272.74, II군 2276.06±217.73, III군 2238.05±192.62, IV군 2620.78±292.4 pg/ml이었고, I군 비해 II, III, IV군에서 통계적으로 유의하게 증가하였으며(p<0.05), IV군은 II군과 III군에 비해 유의하게 증가하였다(p<0.05).

비세정액 및 기관지폐포세정액 내의 호산구와 림프구 수

호산구(Fig. 4A)
   비세정액 내에서 측정한 호산구 수는 I군이 0.5±0.5개, II군이 4.8±1.9개, III군이 4.4±2.5개, IV군이 5.3±2.5개이었고, I군에 비해 II, III, IV군에서 통계적으로 유의하게 증가하였다(p<0.05). 
   기관지폐포세정액 내에서 측정한 호산구 수는 I군이 0.3±0.6개, II군이 8.8±2.6개, III군이 7.6±2.6개, IV군이 10.3±2개였고, I군 비해 II, III, IV군에서 통계적으로 유의하게 증가하였으며(p<0.05), IV군은 III군에 비해 유의하게 증가하였다(p<0.05).

림프구(Fig. 4B)
   비세정액 내에서 측정한 림프구 수는 I군이 1.1±0.7개, II군이 5.2±2개, III군이 4.9±3.2개, IV군이 3.5±1.6개 였고, I군에 비해 II, III군에서 통계적으로 유의하게 증가하였고(p<0.05), IV군은 II군에 비해 통계적으로 유의한 감소를 보였다. 기관지폐포세정액 내에서 측정한 림프구 수는 I군 2.8±1개, II군 25.5±18.9개, III군 16.8±6.3개, IV군 23.8±7.4개였고, I군 비해 II, IV군에서 통계적으로 유의하게 증가하였다(p<0.05).

Trichrome 염색(Fig. 5)
   비강 및 폐조직에서 상피하 섬유화 정도를 알아보기 위해 trichrome 염색을 시행한 결과 폐조직에서는 I군에 비해 II, III, IV군에서 상피하 섬유화가 통계적으로 의미 있게 증가하였고, II, III군에 비해 IV군에서 섬유화가 통계적으로 의미있게 증가하였다. 비강내 조직에서도 I군에 비해 II, III, IV군에서 상피하 섬유화가 의미 있게 증가하였고, II군과 III군에 비해 IV군에서 섬유화가 의미 있게 증가하였다.

면역조직화학염색

MMP-9의 발현(Fig. 6)
   폐조직의 경우 II, III, IV군에서 I군에 비해 MMP-9의 발현이 통계적으로 의미 있게 증가하였고 IV군에서는 II, III군에 비해 그 발현이 통계적으로 의미 있게 증가하였다.
   비강조직에서는 II, IV군에서 I, III군에 비해 MMP-9의 발현이 통계적으로 의미 있게 증가하였고, II군과 IV군 사이에는 통계적으로 의미 있는 차이는 없었지만 II군에 비해 IV군에서 MMP-9의 발현이 증가하는 경향을 보였다.

TIMP-1의 발현(Fig. 7)
   TIMP-1도 폐조직에서는 II, III, IV군에서 I군에 비해 통계적으로 의미 있게 발현이 증가하였고, IV군에서는 II, III군에 비해 그 발현이 의미 있게 증가하였다.
   비강조직에서는 II군과 IV군에서 I군과 III군에 비해 통계적으로 의미 있게 발현이 증가하였다. II군과 IV군 사이에서는 통계적으로 의미 있는 차이는 보이지 않았지만 IV군에서 II군에 비해 TIMP-1의 발현이 증가하는 경향을 보였다.

고     찰

   알레르기비염, 기관지 천식과 같은 알레르기 질환은 조직학적 구조와 기능적 구조의 변화를 거치는 만성염증과정을 통해 기도 재형성이 일어나게 된다. 임상적으로 천식을 동반하지 않는 알레르기 비염 환자에서 정상인에 비해 기관지 점막 하에 I형과 II형 collagen의 상피 하 침착이 증가되었다는 보고도 있고,⁹⁾ 알레르기비염 환자에서 collagen에 대한 면역염색을 시행한 결과 collagen의 종류에 따른 조직 내 침착부위는 정상인과 비슷하였지만 기저막내에서는 I형과 III형의 collagen이 높은 반응성을 보이고, 기저막 또한 정상인에 비해 유의하게 비후된 사실을 보고한 연구결과도 있다.¹⁰⁾ 본 연구에서도 trichrome을 이용하여 기저막의 비후와 상피하 섬유화 여부를 관찰한 결과 난알부민에 장기간 노출한 군과 오존에 노출한 군에서는 폐조직 뿐만 아니라 비강점막에서도 기저막의 비후와 섬유화가 관찰되었으며, 난알부민과 오존에 함께 노출한 군에서는 그 두께와 섬유화의 정도가 더욱 증가하는 것을 뚜렷하게 관찰할 수 있었다. 그리고 기존의 보고에서 언급하였듯이 폐조직에 비해 비점막에서는 그 정도가 심하지는 않았다.^5,6)
   Matrix metalloproteinase(MMP)는 주로 조직구조세포와 염증세포로부터 합성되는 기질특이적인 endopeptidase이며, 주로 세포 외 기질을 분해하는 역할을 한다.¹¹⁾ MMP의 세포 외 기전은 tissue inhibitors of metalloproteinase (TIMP)에 의해 조절된다. 기존의 연구에서 MMP-9과 TIMP-1 등이 기관지 천식 환자의 객담과 기관지 조직에 다량 함유되어 있으며, 그 중 MMP-9의 발현 정도는 기관지 천식 환자 기저막에서의 collagen 침착 정도와 유의한 관련성을 가진다고 보고하고 있다.¹²⁾ 본 연구에서도 면역조직화학염색을 통하여 기도의 재형성과 밀접한 관련이 있는 MMP-9과 TIMP-1의 발현을 측정하였다. 그 결과 폐조직에서는 MMP-9과 TIMP-1 발현이 trichrome 염색 양상과 유사한 결과를 보였다. 반면 비강조직에서는 난알부민을 분무한 군과 오존과 난알부민을 같이 노출한 군에서 대조군과 오존에 노출한 군에 비해 MMP-9과 TIMP-1의 발현이 의미 있게 증가하였고, 오존과 난알부민을 같이 노출한 군에서는 MMP-9과 TIMP-1의 발현이 증가하는 경향을 보였지만 trichrome 염색에서처럼 난알부민 분무군과 오존노출군에 비해 뚜렷한 증가는 보이지 않았다. 이는 측정방법의 예민도가 낮아 발생한 것으로 판단되며 RT-PCR 또는 In situ hybridization 등의 방법을 이용하여 mRNA 수준에서 정량적인 측정을 한다면, 다른 결과를 얻을 수도 있다고 생각한다.
   MMP-9의 분비는 TNF-α, IL-1β 같은 사이토카인에 의해서 증가하는 것으로 알려져 있다.¹³⁾ 한편 기도 상피가 오존에 노출되면 TNF-α, IL-1β뿐만 아니라 IL-4, IL-6, IL-8 등도 증가하는 것으로 알려져 있다.¹⁴⁾ 본 연구에서는 이러한 사이토카인을 측정하지 않았지만 면역염색에서 오존만을 노출한 군의 폐와 비강점막에서도 MMP-9이 발현됨을 볼 수 있었고, 난알부민과 오존에 동시에 노출한 군의 페조직에서 난알부민 단독 노출군에 비해 발현이 증가함을 볼 수 있었다. 따라서 오존에 장기간 노출될 경우 이러한 사이토카인들에 의해 MMP-9의 생성이 촉진되며 알레르기비염 혹은 천식이 동반된 경우에는 MMP-9의 생성이 오존에 의해 더욱더 증가할 수 있을 것으로 생각한다.
   TGF-β는 연골세포, 골세포, 섬유모세포, 혈소판, 단핵구, 일부 T 림프구 등에 의해 생산된다.¹⁵⁾ TGF-β는 섬유화를 일으키는 중요한 자극제이며 세포외 기질을 생성하고 상처의 치유와 반흔생성에 관여하는 것으로 알려져 있다.¹⁵⁾ 일반적으로 천식 환자의 기관지폐포세정액에서 TGF-β의 농도는 정상인에 비해 증가해 있으며, 항원에 노출되어 염증반응이 지속되면 그 농도 또한 증가하는 것으로 보고되고 있다.¹⁶⁾ 반면에 알레르기비염 환자의 비강 내에서는 TGF-β의 농도가 정상인과 비교했을 경우에 비해 그리 높지 않다는 보고와,¹⁷⁾ 알레르기비염에서 TGF-β와 그 수용체의 발현이 증가된다는 상반된 보고가 있다.¹⁸⁾ 본 연구에서는 TGF-β의 농도가 기관지폐포세정액뿐만 아니라 비강세정액에서도 대조군에 비해 난알부민 노출군에서 통계적으로 유의하게 증가함을 보였다. 따라서 TGF-β가 비강에서도 상피세포의 지속적인 활성화 및 그 유지와 밀접하게 관련되어 있으며, 결국에는 상피뿐만 아니라 간질조직의 변화까지 초래할 수 있을 것으로 생각한다. 또한 오존노출군의 기관지폐포세정액과 비강세정액에서 TGF-β 농도가 통계적으로 유의하게 증가하였고 난알부민과 오존을 같이 노출한 군의 경우 난알부민 단독노출군에 비해 기관지폐포세정액의 TGF-β 농도가 유의하게 증가하여 오존이 기도재형성에 어느 정도 기여할 수 있음을 알 수 있었다.
   IL-13은 Th2 림프구에 의해 일어나는 조직 섬유화에서 핵심적인 매개체로 여겨지고 있고, 생체 외 실험에서 섬유모세포의 증식과 collagen 생성을 일으키는 자극제로 알려져 있다.^19,20) 본 연구에서는 비강과 기관폐포세정액 내에서 IL-13의 농도를 측정한 결과 난알부민과 오존 노출 모두 IL-13의 생성을 증가시키는 것을 알 수 있었다. 특히 난알부민과 오존을 동시에 노출시켰을 때에는 각각을 따로 노출시켰을 때보다 IL-13 생성에 대한 상승효과가 있음을 알 수 있었다.
   본 연구에서는 오존에 의한 기도재형성 과정에 어떠한 면역반응으로 이동하는지를 관찰하기 위해 각 군에서 IFN-γ와 IL-5를 측정하였다. 비세정액 내에서는 각 군 사이에 IFN-γ 농도의 차이가 없었으나 기관폐포세정액 내에서는 실험군(Group II, III and IV)에서 대조군에 비해 IFN-γ의 농도가 증가하는 양상을 보였지만 각 실험군 사이에 차이가 없었다. 반면 IL-5의 농도는 비세정액과 기관지폐포세정액 모두 II, III, IV군에서 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 증가함을 보였으며, IV군에서는 II군과 III군에 비해 더욱더 증가함을 관찰할 수 있었다. 이것은 난알부민 감작 마우스에서 난알부민의 노출에 의해서 뿐만 아니라 오존에 의해서도 Th2 유사반응양상이 나타나며, 난알부민과 오존에 동시에 노출하는 경우 상승효과가 나타난다는 것을 알 수 있었다. 따라서 오존노출 후 나타나는 이러한 Th2 유사 반응도 오존에 의한 기도재형성과정에 관여할 수 있을 것으로 생각한다. 
   본 연구에서는 호산구와 함께 림프구의 수도 측정하였다. 그 결과 오존과 난알부민을 따로 노출시킨 군(Group II와 Group III)은 대조군에 비해 비세척액에서 림프구의 수가 증가하였지만, 같이 노출한 군(Group IV)은 II군과 III군에 비해 감소한 것을 알 수 있어 증가된 사이토카인이 호산구 증가에 보다 강하게 작용한 것을 알 수 있었다.

결     론

   마우스를 오존에 장기간 노출하였을 때 기관폐포세정액 및 비세정액 내에서 호산구 증가와 함께 IL-5, IL-13, TGF-β와 같은 사이토카인이 증가함을 관찰하였으며 비강 및 폐조직에서 상피하 섬유조직의 증가와 함께 MMP-9과 TIMP-1의 발현이 증가함을 관찰하였다. 또한 오존을 난알부민 감작 마우스에서 난알부민과 함께 장기간 노출하였을 때 난알부민에만 노출한 경우보다 기도재형성과정이 더 증폭되어 나타남을 알 수 있다. 따라서 오존에 장기간 노출되었을 경우에는 알레르기 항원에 장기간 노출하였을 때와 비슷한 기도재형성이 일어나며 폐를 포함한 하기도에 비해 비점막에서는 그 정도가 광범위하지 않은 것으로 생각된다. 

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