Address for correspondence : Dong Wook Lee, MD, Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Chungbuk National University College of Medicine, 410 Gaesin-dong, Heungdeok-gu, Cheongju 361-711, Korea
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서     론

   종양은 다단계적 다발성 유전자 변화가 체세포에 단계적으로 축적되어 세포의 성장 조절능력이 상실되어 일어나는 것으로 알려져 있으며 최근 종양에 대한 분자생물학적 연구가 활발히 진행되어 암은 유전자 질환으로 밝혀지고 있다. 암유전자, 종양 억제 유전자, 유전자 세포의 노화나 세포 자멸사(apoptosis) 등과 관련된 유전자의 변이들이 알려져 있으며 이러한 유전자변이는 염색체의 자리옮김, 결손, 증폭 등의 현상으로 나타날 수 있다.¹⁾ 이러한 유전자변형을 찾기 위하여 다양한 세포 유전학적 혹은 분자유전학적 기법들이 이용되어 왔으며 이에 의해 발견된 특이적인 염색체 DNA 변이는 암의 진단이나 예후를 평가하는데 적용될 수 있다.²⁾ 형광 제자리 보합법(fluorescence in situ hybridization, FISH), 이형접합체소실(loss of heterozygosity, LOH) 분석, 서던 보합법(Southern hybridization)은 특정 탐침자를 이용하여 염색체변이를 조사함으로써 종양발생과 관련된 이미 알려진 유전자분석에 많은 도움을 준다.³⁾ 그러나 이러한 기법들은 특정 탐침자만을 이용하여 검사하므로 염색체의 어느 특정 부위의 변이만을 알 수 있으며 모든 유전체상에서의 염색체이상을 알기 위해서는 많은 시간과 경비가 드는 단점이 있다.
   비교유전체보합법(comparative genomic hybridization, CGH)은 새로운 FISH 방법의 일종으로 기존의 세포 유전학적 분석방법으로는 쉽지 않은 모든 염색체상에서의 정상 염색체에 대한 상대적인 염색체 변화를 한 번에 알 수 있게 해준다.⁴⁾ 이 방법으로 여러 고형암에서 이러한 연구가 활발히 진행되어 왔다.^4,5) 그러나 CGH에도 몇 가지 단점이 있는데 가장 큰 문제가 되는 것은 해상도가 20 Mb(megabase)로 감별력이 낮아 변형 유전자의 위치를 정확히 검출해내지 못한다는 것에 있다.
   최근 이용되고 있는 array-based CGH(array CGH)는 새로운 CGH 방법으로 종양조직의 DNA와 정상 DNA를 정상 중기 염색체에 결합시키는 대신 microarray template에 결합시키는 방법이다. Microarray template는 암유전자를 포함한 모든 유전자의 정확한 위치를 아는 클론을 배열한 슬라이드라고 할 수 있다. 따라서 array-CGH는 단한번의 실험으로 염색체 증가와 감소를 알 수 있는 획기적인 방법으로 그 감별력은 기존의 CGH에 비하여 매우 높아 1~2 Mb 이하의 해상도를 나타내게 된다.⁶⁾
   두경부암은 상부기도소화관의 다양한 부위에 발생하는 악성종양이고 대표적으로 구강암 인두암 그리고 후두암 등이 있다. 두경부암은 대부분 상부기도소화관의 편평상피세포에서 발생하기 때문에 좁은 의미의 두경부암은 두경부의 편평상피세포암과 동일한 의미로 통용된다. 과거 수십 년간 두경부 편평상피세포암의 치료 성적은 전반적으로 정체된 상황으로 기존의 치료 방법에 대한 한계점이 대두되고 있다. 이러한 측면에서 두경부 편평상피세포암에 대한 좀 더 체계적인 세포유전학적 이해가 절실한 상태이고 이를 바탕으로 한 새로운 진단 및 치료 방법의 개발이 필요한 상태라고 하겠다.
   두경부 편평상피세포암 세포주 PCI-1, 13, 50은 다양한 연구에 널리 이용되고 있는 세포주이다. PCI-1은 설암, PCI-13은 구후삼각암(retromolar trigone) 등 구강암의 호발부위를 반영하여 수립되었다. 그리고 PCI-50은 후두암으로부터 수립되어 여러 연구에서 사용되고 있는 세포주이다.⁷⁾ 각 세포주는 다양한 두경부암의 발생부위 중 대표적인 부위를 반영한다고 볼 수 있다. 본 연구에서는 두경부 편평상피세포암의 발생과 진행에 관련 가능성이 있는 대상유전자가 위치하는 염색체 부위를 알아보기 위하여 두경부 편평상피세포암의 대표적 원발 부위에서 수립된 세포주 PCI-1, 13, 50의 염색체 변화를 CGH를 이용하여 규명하고자 하였다. 아울러 array-CGH를 이용하여 두경부 편평상피세포암 세포주에서의 유전자발현 양상에 대한 정보를 조사 분석하고자 하였다.

재료 및 방법

두경부 편평상피세포암 세포주의 배양 및 유전체 DNA 추출
   세 가지 종류의 두경부 편평상피세포암 세포주 PCI-1, PCI-13, PCI-50가 사용되었다. 세 세포주는 University of Pittsburgh에서 확립 제공되었다.
   PCI-1 세포주는 설암, PCI-13 세포주는 구후삼각암 그리고 PCI-50 세포주는 후두암으로부터 각각 신선하게 채취되어 확립되었다. 이들 세포주는 모두 항암치료나 방사선치료를 받지 않은 환자들로부터 확립된 세포주이다. RPMI 1640 배지에 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco/BRL, Rockville, MD, USA)를 넣어 5% CO₂ 하에 37℃에서 배양하였다. 배양액은 2~3일에 한 번씩 갈아 주었으며 세포가 플라스크에 90% 이상 부착되어 자랐을 때 4개의 플라스크에 나누어 계대 배양하였다.
   세포주의 유전체 DNA는 Wizard genomic DNA purification kit(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 추출하였다. 세포가 플라스크에 꽉 찼을 때 0.25% trypsin-EDTA(Gibco/BRL, Rockville, MD, USA)로 세포를 분리시키고 PBS(phosphate buffered saline, Gibco/BRL, Rockville, MD, USA)로 trypsin의 작용을 멈추게 한 후 실온에서 1,000 rpm, 5분간 원심분리하여 세포를 수확하였다. PBS 1 mL을 첨가하여 실온에서 8,000 rpm, 20초간 원심분리하고 침전을 보존하였다. 여기에 핵분해 용액 600 μL을 첨가하여 잘 혼합하고 RNase 3 μL를 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 실온으로 식힌 후 단백질 침전 용액 300 μL 첨가하여 잘 혼합한 후 실온에서 14,000 rpm, 4~8분간 원심분리 후 상층액을 새 튜브로 옮기고 100% 에탄올 600 μL를 첨가하여 잘 섞고 -70℃에서 30분간 둔 후 4℃에서 15,000 rpm으로 2분간 원심분리하였다. DNA 침전이 보이면 상층액을 버리고 70% 에탄올을 1 mL 넣고 실온에서 2,000 rpm, 2분간 원심분리하고 상층액을 버리고 실온에서 15분간 잘 건조하였다. DNA 재용해 용액을 DNA 양과 비교하여 첨가하고 녹인 후 DNA의 농도와 순도를 측정하였다.

정상 대조군의 유전체 DNA 추출
   Giemsa banding으로 정상핵형(46, XY)을 가진 것으로 판명된 건강한 정상 성인 남자의 혈액 내 백혈구로부터 정상 DNA를 추출하였으며 Wizard genomic DNA purification kit(Promega, Madison, USA)를 이용하였다. Heparin이 들어있는 tube에 3 mL의 전혈을 담고 잘 섞은 후 1.5 mL tube에 300 μL씩 나누어 담았다. 900 μL의 세포분해용액을 첨가하여 잘 섞고 실온에 10분간 두어 적혈구를 파괴시킨 후 15,000 rpm, 실온에서 20초간 원심분리하여 상층액을 버린 후 침전을 잘 혼합하고 300 μL의 핵분해 용액을 첨가하였다. 백혈구를 파괴하기 위해 37℃에 1시간 둔 후 RNase 1.5 μL를 첨가하고 다시 37℃에서 15분간 반응시켰다. 실온으로 식힌 후 100 μL의 단백질 침전용액을 첨가하고 단백질 덩어리들이 보일 때까지 잘 혼합한 후 15,000 rpm, 실온에서 3분간 원심분리 후 상층액을 새 튜브로 옮겼다. 100% 에탄올 600 μL를 첨가하여 잘 섞고 -70℃에 30분간 둔 후 4℃에서 15,000 rpm으로 30분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 70% 에탄올을 1 mL 넣고 15,000 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리 후 상층액을 버리고 실온에서 15분간 잘 건조시켰다. DNA 재용해 용액을 DNA양과 비교하여 첨가하고 녹인 후 DNA의 농도와 순도를 측정하였다.

Nick translation에 의한 DNA 표지
   Nick translation kit(Roche, Basel, Switzerland)를 이용하여 시행하였으며 세포주 DNA에 대하여는 biotin-16-dUTP로 정상 DNA에 대하여는 digoxigenin-11-dUTP로 표지하였다. 20 μL의 nick translation 혼합물[1 μg DNA, 4 μL biotin(or dig)-dUTP, 1 μL DNA polymerase I, ddH2O]을 15℃에서 90분간 반응시키고 68℃에서 15분간 두어 반응을 정지시킨 후 1% agarose gel에서 전기영동하여 DNA 크기를 확인하였다.

정상 중기 염색체 표본 작성
   정상 성인 말초혈액을 15% FBS와 phytohemagglutinin(PHA)를 첨가한 RPMI-1640, 5% CO2, 37℃에서 3일간 배양한 후 정상 중기세포를 수확하였다. 중기세포를 colcemid 0.1 μg로 30분간 처리하고 tube에 옮겨 실온에서 1,000 rpm, 5분간 원심분리하고 부유물을 버린 후 저장액(0.075 M KCl)을 넣어 37℃에 20분간 둔 후 고정액(methanol：acetic acid=3：1)으로 세 번 처리하여 정상중기 염색체 슬라이드를 제작하였다. CGH를 위한 슬라이드로는 세포질이 없고 염색체가 구부러지거나 겹치지 않으며 잘 퍼진 것을 골라 70%, 85%, 100% 에탄올에 차례로 탈수한 후 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.

Hybridization 및 결과 분석
   탐침자 혼합물(1 μg labeled control DNA, 1 μg labeled tumor DNA, 40 μg human cot-1 DNA)에 0.1배의 3 M sodium acetate와 2배의 100% 에탄올을 첨가하여 에탄올을 침전시킨 후 10 μL의 master hybridization solution(50% formamide, 10% dextran sulfate, 2×SSC, pH 7.0)에 재용해하여 75℃에서 5분간 변성시킨 후 37℃에서 30분간 미리 결합시켰다. 정상 중기 염색체 슬라이드는 65℃에서 1분 동안 변성시킨 후 70%, 85%, 100% 에탄올에서 각각 2분간 차례로 탈수하였다. 슬라이드에 변성시킨 탐침자를 얹고 가장자리를 봉하여 37℃에서 2~3일간 마르지 않도록 주의하며 hybridization하였다.
   수세 용액(50% formamide, 2×SSC, pH7.0)으로 45℃에서 10분간 3회 2x SSC 용액으로 45℃에서 3회 실온에서 1회 수세하고 1% bovine serum albumin(BSA), 4×SSC를 얹어 37℃에서 5~20분간 두고 FITC(fluorescein isothiocyanate, Oncor, Gaithersburg, USA)로 37℃에서 70분간 반응시킨 후 4×SSC로 45℃에서 2분간 3회 수세한 후 다시 1% BSA, 4×SSC를 얹어 37℃에서 5~20분간 두고 biotinylated antiavidin과 antidigoxigenin-rhodamin으로 37℃에서 90분간 반응시킨 후 4×SSC로 45℃에서 2분간 3회 수세하고 다시 FITC로 37℃에서 60분간 반응시킨 후 4×SSC로 45℃에서 2분간 3회 수세하고 공기 건조하였다.
   공기 건조한 슬라이드에 DAPI(4'-6'-diamidine-2-phenylindole dihydrochloride, Vysis, Downers Grove, USA)로 대조염색하고 CGH CytoVision system(Applied Imaging, San Jose, USA)을 이용하여 관찰하였다. DAPI 염색에 기초하여 겹치지 않고 잘 퍼진 10~15개 정도의 중기세포 염색체를 분석하여 적색 정상 DNA에 대한 녹색종양 DNA의 비율을 평균하여 구한 다음 적색에 대한 녹색의 비율이 1일 때를 기준으로 하여 적색에 대한 녹색의 비율이 1.25 이상을 염색체 증가(gain)로 0.75 이하를 염색체 감소(loss)로 분석하였다. 특히 그 비율이 1.50 이상인 경우는 염색체 증폭(amplification)으로 정의하였다.

Array-CGH
   두경부 편평상피 세포암 세포주에서 추출한 DNA는 Cy3로 표지하고 정상 세포에서 추출한 DNA는 Cy5로 표지한 후 cot-1 DNA를 포함한 부합 완충액(hybridization buffer)에 탐침자를 혼합하여 70℃에서 15분간 변성시킨 후 37℃에서 60분간 미리 결합시켰다. Genom Array(Macrogen, Seoul, Korea)는 1,440개의 bacterial artificial chromosome(BAC) 클론으로 이루어진 것으로 FISH를 통해 그 위치가 확인된 microarray template이다. Genom Array를 70℃에서 15분간 변성시킨 다음 혼합된 탐침자성시 microarray template을 37℃에서 48~72시간 동안 결합시켰다. 수세용액(50% formamide, 2×SSC)으로 46℃에서 15분간 수세하였고 2×SSC, 0.1% SDS로 46℃에서 30분간 둔 후 PN buffer로 실온에서 15분간 둔 후 2×SSC로 실온에서 5분간 수세하였다.
   실온에서 1분간 차례로 70%, 85%, 100% 알코올에 담구어 탈수한 후 공기 건조하였다. Image captur 변성시 분석은 Array Scanner(Macrogen)와 Array Analysis(Macrogen)를 이용하였다. Array CGH의 결과는 Cy3/Cy5 fluorescence ratio의 log값을 구해 0.25 이상인 경우를 염색체 증가로 하였으며, -0.25 이하인 경우를 염색체 감소로 분석하였다.

결     과

두경부 편평상피세포암 세포주에서 추출한 DNA의 nick translation
   두경부 편평상피세포암 세포주 PCI-1, PCI-13과 PCI-50으로부터 추출한 DNA를 nick translation으로 표지한 후 나타난 DNA의 크기는 500~3,000 bp의 크기였다. 정상 유전체 DNA를 nick translation으로 표지한 후 전기영동하여 확인한 DNA의 크기는 500~3,000 bp임을 확인하였다(Fig. 1).

CGH 결과
   세 개의 세포주에서 다양한 염색체 변화가 관찰되었으며 19~26개의 염색체에서의 변화를 관찰할 수 있었다(Table 1).

PCI-1의 CGH 결과
   CGH를 시행하여 탐침자의 fluorescence image를 얻었고 컴퓨터 분석을 통해 profile을 얻었다(Fig. 2). 염색체 증가로 나타난 부위는 2q35-q36, 3q25-qter, 5p, 7pter-q21, 8q11.2-qter, 9q13-qter, 10q22, 10q26-qter, 11p15-pter, 11q, 12pter-q13, 12q24.2-qter, 13q12-q14, 16q, 17p10-p13, 17q21-qter, 19p13.1-pter, 19q13.1-qter, 20, 21q22-qter, 22q였으며 이중 3q28-qter, 5p14, 8q12, 9q22-qter, 11q12-q13, 16q10-q21, 17p12, 17q25, 19p13.2-p13.3, 19q13.1-q13.3, 20에서는 염색체의 증폭이 관찰되었다.
   염색체 감소로 나타난 부위는 3pter-q13.1, 4p15-qter, 8p22-pter, 10p10-p14, 15q11.2-q14, 16p12, 18p11.2-qter의 일곱 부위였다(Table 1).

PCI-13의 CGH 결과
   CGH를 시행하여 탐침자의 fluorescence image를 얻었고 컴퓨터 분석을 통해 profile을 얻었다(Fig. 3). 염색체 증가로 나타난 부위는 1q23-q31, 1q32-qter, 6p23-pter, 6p21.2, 7q33-qter, 8q22-qter, 9q32-qter, 10q22, 10q23-qter, 12q24.1, 13q13.3-qter16q12.1-qter, 17, 19p13.2-pter, 19q13.3-qter, 20 등이었으며 이 중 17p13, 17q22-qter, 20p11.2-p13, 20q11.2-qter 등 네 부위에서는 염색체 증폭을 관찰할 수 있었다. 한편 염색체 감소로 나타난 부위는 7q11.2-q21, 21q21, 22q10-q12임을 확인하였다(Table 1).

PCI-50의 CGH 결과
   CGH를 시행하여 탐침자의 fluorescence image을 얻었고 컴퓨터 분석을 통해 profile을 얻었다(Fig. 4). 염색체1p21-p31, 3q27-qter, 4p13-p14, 4p15-pter, 5p15-pter, 7p13-pter, 7q10-q22, 8q22-qter, 9q13-q22, 9q31-qter, 10q22-qter, 11q13, 12p12-peter, 12q13-qter, 13q33, 14q31, 15q26, 16, 17, 18pter-q12, 19p13.1-pter, 19q13.2, 20q에서 증가가 관찰되었다. 특히 염색체 7p22, 7q11.2, 10q25, 18pter-q12 등 네 부위에서는 염색체의 증폭을 관찰할 수 있었다. 염색체 감소가 나타난 부위는 2q33-q37, 3p, 4q21-qter, 18q21-qter였다(Table 1).

Array-CGH 분석
   세 개의 세포주 모두에서 다양한 염색체의 변화가 관찰되었으며 다수의 유전자의 증가나 감소가 있음을 확인하였다. 3개의 세포주 모두에서 증가하거나 감소한 유전자를 정리한 결과는 Table 2와 Table 3에서 보는 바와 같다. 3개의 세포주에서 공통적으로 증가 혹은 감소된 유전자 중 알려진 유전자는 다음과 같았다(Figs. 5, 6 and 7). 증가된 유전자는 AHRR, CCND1, DBH, MYT1, NELF, PTGIS, PKT6, SARDH, SKI, SNAI1, SNTA1, TERT, TPPP, TRAF7, VAV2, ZNF313이었으며 감소된 유전자는 ELAVL4, GRM7이었다.

고     찰

   비교유전체보합법(CGH)은 고형암에서 다양한 염색체이상을 발견하고자 하는 종양세포 유전학적 방법 중 매우 민감도가 높은 방법이다. 기존의 세포 유전학적 방법과는 달리 암세포를 배양하지 않아 세포배양에 따른 클론의 진행과 같은 문제를 해결할 수 있게 하여 주며 FISH처럼 어떤 특정한 염색체 부위에 대한 검색이 아닌 모든 유전체상에서의 검색이 가능한 방법이다. 그러나 CGH는 암세포 외에 정상세포 괴사성 물질, 염증세포 등이 혼합된 경우에는 형광 비율이 희석되어 정확한 염색체이상을 밝힐 수 없는 한계가 있다. 또한 전체 암조직의 평균적인 염색체 증가와 감소만을 나타내기 때문에 자리옮김이나 역위 등의 균형적 재배열은 분석할 수 없으며 비교적 해상력이 낮다는 단점이 있다. 이러한 한계에도 불구하고 CGH는 상대적으로 짧은 시간에 DNA만을 이용하여 염색체이상을 쉽게 밝힐 수 있어 세포배양이 어려운 고형암에서 매우 유용하다.
   Array-CGH는 CGH를 좀 더 발전시킨 방법으로 CGH가 중기 염색체를 이용하는 것과 달리 이미 위치가 밝혀진 유전자 또는 염기서열을 배열한 슬라이드를 이용함으로써 염색체이상의 위치를 좀 더 정확히 알 수 있으며 이와 관련유전자를 밝힐 수 있는 새로운 방법이다. 그러므로 암연구에서의 array-CGH는 암의 발생 및 진행과 관련된 유전자를 규명하는데 이용될 수 있다.
   CGH와 array-CGH는 모두 두경부암의 연구에서도 이미 적용되어 왔다. Bockmühl 등⁸⁾은 CGH를 이용하여 50례의 두경부암에서 염색체이상을 분석 CGH가 두경부암의 유전자변이를 연구하는데 도움이 되는 기법이라고 보고하였다. Squire 등⁹⁾은 CGH와 special karyotyping, 그리고 expression array 결과를 같이 분석하여 두경부암에서의 유전자이상이 염색체의 구조적 변이를 초래하는 기전을 설명하고자 하는 모델을 제시한 바 있다. 한편 Wreesman 등¹⁰⁾은 경부전이를 동반한 두경부암에서 원발 부위와 경부전이 부위의 종양 세포내에서 발견되는 유전자변이를 본 기법을 이용하여 분석한 바 있다. 이상의 기존 연구가 시사하듯 CGH와 arrayed CGH를 이용한 유전자 분석은 두경부암 영역에서도 점점 활발히 적용되고 있는 추세이나 아직 다른 고형암에 비하여 그 연구 결과가 미미한 실정이다. 그리고 이러한 기법을 이용한 염색체 분석을 시도한 국내의 보고는 거의 없는 상황이다.
   본 연구에서 세 개의 세포주 모두에서 증가한 염색체 부위는 8q22-qter, 9q32-qter, 10q22, 10q26-qter, 16q12.1-qter, 17p10-p13, 17q21-qter, 19p13.2-pter, 20q였다 세포주 3개 모두에서 감소한 염색체 부위는 없었으나 염색체 3p, 4q21-qter, 18q21-qter의 감소가 두 개의 세포주에서 관찰되었다.
   이러한 결과는 다른 연구자의 보고와 비교적 잘 일치하고 있다. 두경부 편평상피세포암에서 3q, 8q, 9q, 20q, 7q, 11q13, 5q 등의 증가와 3p, 9p, 21q, 5q, 13q, 18q, 8p 등의 감소가 관여한다는 보고가 있다.¹¹⁾ 두경부 편평상피세포암에서 가장 흔한 것으로 보고된 염색체이상은 3q의 증가 및 3p의 감소이다. 본 연구에서는 PCI-13을 제외한 두 개의 세포주에서 3q의 증가와 3p의 감소가 관찰되었다.
   본 연구에서 규명된 8q의 증가는 MYC 유전자의 증폭과 관련이 있다는 점이 Yin 등¹²⁾의 정량 dot blot 분석에서 규명된 바 있다. 이 연구에서는 정상 세포군과 비교하여 34예의 두경부 편평세포암 세포주를 분석하여 MYC 유전자의 증폭과 통계적으로 반비례 관계를 보인다고 보고되었다. Agochiya 등¹³⁾은 FISH 기법을 이용하여 MYC과 PTK2(focal adhesion kinase; protein tyrosine kinase 2)의 증가가 두경부 편평세포암을 포함하여 폐암 대장암 그리고 유방암 세포주에서 발견된다고 보고하였다. PTK2 focal adhesion gene은 종양의 성장과 전이에 관련된 세포 전달기전에 중요하게 관여하는 인자이므로 이 부분에 대한 규명이 필요할 것으로 생각된다. 본 연구의 array-CGH 결과에서는 PCI-13 세포주를 제외한 두 개의 세포주에서 MYC 유전자의 증가를 확인하였다. 염색체 10q의 증가는 두경부 편평상피세포암에서는 많이 보고되지 않았으나 Poetsch 등¹⁴⁾은 기저양 편평상피세포암(basaloid squamous cell carcinoma)과 일반적인 두경부 편평상피세포암을 비교한 연구에서 10q 증가가 일반적인 두경부암에서 기저양 편평상피세포암보다 많이 나타남을 보고하였다. 이 연구에서는 기저양 편평상피세포암은 일반적인 두경부암에 비하면 인간 유두종 바이러스(human papilloma virus)의 반응빈도가 낮은데 이러한 현상과 본 염색체이상이 관련이 있을 것으로 추측한 바 있다. 본 연구에서도 모든 세포주에서 10q22, 10q26-qter의 증가가 관찰되었으며, array-CGH 결과 10q26.3 위치에 KDNC1, UTF1, VENTX2 유전자가 세 개의 세포주 모두에서 증가함을 확인한 바 이에 대해서는 향후 구체적인 연구를 요할 것으로 생각된다.
   염색체 17q의 증가는 식도암 위암 등에 대한 여러 연구에서 밝혀져 있다. Shahabi 등¹⁵⁾의 연구에서 식도암에서 이 부위는 TOC locus와 관련이 있으며 17q25의 증가가 식도암의 발생기전에 관여할 가능성이 있다고 기술하였다. Ashman 등¹⁶⁾은 17q 증가가 관찰되는 경우 환자의 예후가 불량해지는 양상을 보임을 보고하였다. 본 연구에서 관찰된 17q 증가 양상도 두경부암에서 본 유전자이상이 관여 할 가능성이 있음을 시사하는 연구 결과이다. 20q의 증가는 유방암에서 종양의 미분화 정도 홀배수성(aneuploidy), high S-phase fraction 등과 관련된다고 보고되었다. 유방암을 대상으로 한 연구 결과에서는 20q의 증가가 동반된 경우 무병 생존율이 낮아진다는 결과가 보고되고 있다. 이 부위는 유방암에서 주로 발현하는 BCAS1, ZNF217 등과 관계있다. 그러나 두경부 편평세포암에서는 예후와의 관련성이 유방암과 달리 불명확하다. 본 연구에 사용된 세 개의 세포주에서 모두 20q의 증가와 다수의 유전자의 증가가 관찰되었다. PTGIS(prostacyclin synthase gene)는 최근에 알려지기 시작하고 있는 인자이다. 본 유전체는 20q13.13에 위치하고 있고 세포학적 의미에 관한 연구가 시작되고 있는 단계이다. 종양의 세포내 기전에서 본 인자가 어떤 역할을 하는지는 거의 알려져 있지 않으나 최근 연구에서는 대장암 세포주의 발생에 관여할 가능성이 제기되고 있다.¹⁷⁾ ZNF313(zinc finger protein gene)도 20q13.13에 위치하고 있는 인자이다.
   몇몇 연구에서 정상적으로 정자 생성을 하는 남성의 조직에서는 활발히 발현하지만 정자 감소증이 있는 경우는 발현이 적게되는 양상이라는 보고가 있어 향후 이의 구체적 발현기전과 생물학적 의의에 대한 연구가 필요한 상황이다. 종양학적 의미에 대해서는 알려진 것이 별로 없는 유전체이다. MYT1(myelin transcription factor 1)은 20q13.13에 위치하고 있다. 분화도가 좋은 뇌종양에서 면역조직화학적 염색을 시행했을 때 주로 핵내에서 반응하거나 예외적인 경우 세포질 내에서 반응하는 양상을 보이는 인자로 이러한 종양 내 반응은 Ki-67에 대한 반응양상과도 대체로 일치하여 이를 이용하여 중추신경 내 분화도가 좋은 종양의 조기진단에 이용하려는 시도가 있다. 한편 염색체 3p의 감소는 두경부 편평상피세포암뿐 아니라 다양한 암에서 보고되었다. 이 부위는 가장 흔한 염색체 감소부위로 알려져 있다. 이는 구강암의 전암성 세포변성단계에서도 발견되어 두경부 편평상피세포암의 초기변화에서 동반된다고 보고되었다. 이 위치와 FHIT(fragile histidine triad) 유전자와의 관계가 여러 연구에서 조사된 바 있으며 이는 FHIT 유전자의 기능저하가 두경부 편평상피세포암의 진행에 중요한 역할을 함을 시사한다.¹⁸⁾ 이 유전자의 감소는 여러 원발 부위의 종양에서 공통적으로 보고되는 소견이고 유방암 등의 경우 이러한 소견은 나쁜 예후와 관련이 있다는 보고도 있다. 본 연구에서는 두 개의 세포주에서 3p의 감소와 FHIT 유전자의 감소가 확인되었다.
   또한 array-CGH 결과 세 개의 세포주 모두에서 3p26.1 위치의 GRM7 유전자가 감소함을 확인하였다. GRM7(G protein-coupled metabotrophic glutamate receptor 7), CpG island 메틸화시 가장 빈번히 관여하는 유전자로 알려져 있으며 세포사멸을 초래하는 cAMP signaling을 억제하는 역할을 할 것으로 생각되고 있지만 아직 알려진 것이 별로 없는 상황이다. 이러한 결과는 CGH의 낮은 해상력을 array-CGH가 보완할 수 있음을 보여주는 결과로 생각된다.
   염색체 4q의 감소는 두경부 편평상피세포암에 대한 여러 기존 연구에서 밝혀진 바 있다. Lin 등¹⁹⁾은 구강암에서 4q 감소를 보고 하였다. 전체 암의 50% 이상에서 본 현상이 관찰되지만 두경부암 편평세포암에서는 더 현저하게 발견되고 특히 구강암에서 많이 연구되고 있다. 이는 발암과정에서 발암 억제기전에 영향을 줘서 암을 발생시키는 것으로 생각된다. 본 연구에서는 4q21-qter의 감소가 확인되었으나 array-CGH에서 관련된 유전자의 감소는 규명하지 못하였으므로 향후 이에 대한 분석이 필요하다. 염색체 18q의 감소는 두경부 편평세포암에 대한 기존 연구에서 이미 보고된 바 있다. 주로 다섯 부위에서의 감소가 흔한데 이는 18q12, 18q21.1, 18q21.1-q21.3, 18q22.2 그리고 18q23 등이다. 본 연구에서는 18q21-qter에서 감소가 관찰되었다. 여기에 여러 종양억제 유전자가 위치한다고 알려져 있는데 예를 들면 DCC, DPC4, MADR2, the protease inhibitor ovalbumin serpingene, maspin(PI15), SCCA1, SCCA2, PAI2 그리고 headpin(PI13) 등이 있다. headpin 유전자는 정상 구강점막 피부 배양된 각질세포 등에서 정상적으로 발견되지만 구강에 발생한 편평상피세포암에서는 발현이 감소한다고 보고되었다.²⁰⁾ 현재까지는 18q의 감소를 초래하는 자세한 기전은 밝혀져 있지 않으나 18q 감소는 두경부 편평상피세포암의 예후를 불량하게 하는 것과 관련이 있는 중요한 현상이다.
   본 연구에서는 두경부 편평상피세포암 세포주 PCI-1, PCI-13과 PCI-50의 염색체이상을 CGH를 이용하여 분석하였고 또한 CGH의 단점인 낮은 해상력을 보완하며 관련된 유전자를 규명하고자 array-CGH를 시행하였다. CGH와 array-CGH는 두경부 편평상피세포암의 유전적 변화를 규명하는 데 있어 유용한 스크리닝 방법으로서 의의가 있다. 본 연구에서 규명된 이상 염색체 부위는 두경부 편평상피세포암의 발생 및 진행과 관련된 유전자를 포함하고 있는 부위이므로 향후 암의 진단과 치료의 목표가 되는 유전자를 targeting하는데 유용한 정보를 제공할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 array-CGH 결과에서 증가하거나 감소한 유전자는 두경부 편평상피세포암의 발생 및 발달에 관련된 유전자일 가능성이 있다고 생각되며 이러한 부분에 관한 향후 연구가 필요하다고 하겠다.

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